通过遗传转化Rfo获得青花菜Ogura CMS恢复系

【目的】将来自萝卜的胞质不育恢复基因Rfo导入到青花菜Ogura细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)主栽商业品种‘耐寒优秀’(命名为SFB45)中,获得Ogura CMS恢复系,打破Ogura CMS材料在生产上无法再利用的现状,为优异种质的创制和改良提供新途径。【方法】利用基因合成的方法克隆萝卜Rfo的CDS及其启动子序列,构建表达载体pRfo::Rfo。通过农杆菌介导的遗传转化方法侵染SFB45的具柄子叶和下胚轴,进行再生、抗性苗筛选和PCR鉴定获得阳性植株,开花期观察转基因植株的育性恢复情况;用亚历山大染液分析对照组及阳性株的花粉活力;分别提取对照组及阳性株<3 mm和>3 mm花蕾的RNA并反转录成单链cDNA,设计特异引物,利用RT-PCR分析Rfo及绒毡层和花粉壁发育相关基因在SFB45及对应的育性恢复材料花蕾中的表达差异。【结果】通过遗传转化共获得10个阳性株系,其中8个株系育性得到不同程度的恢复,花粉活力为84.2%—90.4%。RT-PCR分析结果表明,育性恢复植株花蕾中Rfo表达,绒毡层发育关键调节因子DYT1和TDF1及花粉壁主要成分孢粉素合成所必需的基因ACOS5在育性恢复植株<3 mm花蕾中上调表达。绒毡层降解相关基因AMS、四分体胼胝质壁及花粉外壁发育所必需的基因CalS5和CYP703在育性恢复植株>3 mm花蕾中上调表达。分析阳性株系R-1、R-3和R-6自交及杂交后代发现转入的Rfo能稳定遗传,符合孟德尔遗传。【结论】通过遗传转化Rfo获得了优良青花菜Ogura CMS商品种SFB45的育性恢复系,且Rfo的转入使绒毡层及花粉壁发育相关基因恢复正常表达。

甘蓝耐裂球性与叶表面微形态及细胞组织结构的关系研究

从细胞学水平上探讨影响甘蓝裂球的原因,为甘蓝耐裂性材料的选育和新品种的育成提供理论依据,并为甘蓝耐裂性鉴定指标的制定提供依据。运用扫描电子显微镜对4份耐裂性不同的甘蓝叶表面微形态及细胞组织结构进行比较观察。结果表明:甘蓝球叶表皮细胞为无规则型,气孔为卵圆形或长椭圆形。材料间下表皮微形态存在较显著的差别:耐裂材料的垂周壁上有明显的波状嵴,平周壁上有加厚的条纹状角质层纹饰,保卫细胞四周角质层褶皱较多、起伏较大,表皮细胞上覆盖有大量的粉状或颗粒状蜡质。易裂材料的垂周壁呈沟槽状下陷,平周壁上角质层光滑,保卫细胞四周角质层较平坦。耐裂材料的叶肉细胞层数多,排列紧密,间隙小。易裂材料叶肉细胞层数少,排列松散,间隙大。耐裂材料与易裂材料在球叶表面微形态及细胞组织结构上表现显著差异。

洋葱胞质雄性不育系及其保持系花蕾内源激素含量和脯氨酸含量的动态变化特征

以洋葱胞质雄性不育系63A及其同核异质保持系63B为试材,研究了花蕾发育过程中IAA、GA3、ZR、ABA含量以及脯氨酸含量的动态变化规律,探讨洋葱不育性与内源激素、脯氨酸含量的关系。结果显示,洋葱不育系花蕾的IAA、GA3、ZR和脯氨酸含量在败育过程中显著低于保持系,而ABA含量则较保持系有不同程度的盈积。且在花药的发育过程中,二者的差异主要发生在单核期,即不育系小孢子败育的主要时期。据此认为,IAA、GA3、ZR、ABA和脯氨酸含量的异常与洋葱雄性不育的发生有关。

结球甘蓝小孢子培养技术体系的优化研究

以20份类型丰富的F1及亲本甘蓝为试材,探讨了不同甘蓝类型、F1及其亲本材料、供体植株的生长温度、供体植株的花期、高温热激时间、NLN培养基pH值等因素对甘蓝小孢子胚胎产量及质量的影响,为建立高效、完善的结球甘蓝小孢子培养技术体系提供依据。结果表明:不同叶球类型与小孢子的产胚率无明显相关性,但不同栽培季节及熟性的甘蓝品种间却存在显著差异,其中春秋类型的早、中熟甘蓝要明显好于晚熟的越冬甘蓝;用产胚能力强与产胚能力弱的材料分别做亲本杂交,所得杂交种的出胚率介于两亲本之间,表明小孢子产胚能力是一种受基因调控的遗传性状;供体植株的生长温度对于结球甘蓝胚状体的产生并无显著影响;从胚胎发生频率及胚胎质量来说,初花后10 d内(开花初期至盛花中期)是取样的最佳花期阶段;对于大多数基因型而言,32.5℃热激预培养48 h较24 h更有利于胚胎发生,热激32.5℃48 h并结合NLN-pH6.2为最佳处理组合,比目前在甘蓝类蔬菜中常用的32.5℃24 h+NLN-pH5.8的培养体系在基因型反应范围及胚胎发生频率方面都有显著提高。

四倍体青花菜小孢子培养及胚胎发育途径研究

以同源四倍体青花菜为试材,进行了游离小孢子培养的胚胎诱导条件及胚胎发育途径的研究。结果表明:基因型是影响四倍体青花菜小孢子胚胎诱导率的重要因子,基因型A36的出胚率最高,达到28.5个·蕾-1;热激胁迫(32.5℃)诱导小孢子从配子体发育途径向胚胎发生途径转换,其小孢子胚胎发育途径为典型的单核期小孢子经对称分裂产生胚胎的途径(B途径);4℃低温预处理1d或2d结合32.5℃热激1 d后,对称分裂和多细胞团增加,供试基因型小孢子出胚率显著提高。本研究将有助于游离小孢子胚胎发生机理的研究,以及其他芸薹属小孢子胚胎体系的建立及优化。

低温胁迫下甘蓝叶片细胞超微结构及叶肉细胞内Ca^(2+)的分布变化

以结球甘蓝幼苗为试验材料,探讨低温胁迫下甘蓝幼苗超微结构及叶肉细胞内Ca2+水平的变化。结果显示:①5℃和2℃低温胁迫时甘蓝幼苗叶肉细胞质膜、液泡膜清晰,叶绿体、线粒体结构没有明显的变化,表明甘蓝幼苗对5℃、2℃低温逆境有一定的适应能力;-2℃低温处理的甘蓝幼苗叶肉细胞出现质膜内陷,大部分叶绿体双层膜结构破坏严重,基粒片层解体,线粒体膜结构受损,脊消失,表明甘蓝幼苗已受到冻害。②未经低温处理的甘蓝幼苗叶肉细胞中焦锑酸钙沉淀颗粒主要分布于液泡和细胞间隙中,细胞壁中也见少量沉淀,而细胞基质中则看不到焦锑酸钙沉淀;经-2℃24 h低温处理后,细胞间隙和液泡中的Ca2+开始释放到细胞质,细胞基质和细胞膜上焦锑酸钙沉淀增加,而液泡和细胞间隙中的焦锑酸钙沉淀减少;经-2℃48 h低温处理后液泡内和细胞间隙中的焦锑酸钙沉淀很少或消失,而细胞基质和细胞膜上则分布有较多的焦锑酸钙沉淀;经-2℃72 h低温处理后,细胞间隙内的焦锑酸钙沉淀极少,有的也紧贴在细胞外壁上,而细胞基质和细胞膜上则分布有非常多的焦锑酸钙沉淀,在核基质和液泡中也见到少量的焦锑酸钙沉淀,并且细胞发生质壁分离,超微结构遭到了显著破坏,表明Ca2+的区域性分布变化与植物抗寒性存在一定关系。

结球甘蓝小孢子胚植株再生体系的优化

游离小孢子培养技术在种质资源创新、加速新品种选育方面的作用已得到广大科研育种工作者的广泛认可与关注。目前，结球甘蓝游离小孢子培养技术取得了很大的进展，尤其是在如何提高小孢子胚胎发生频率方面的技术体系已趋近成熟，但是对小孢子胚植株再生频率的研究缺乏系统性。

温度胁迫对结球甘蓝游离小孢子胚胎发生的影响

以10份结球甘蓝F1为试材,探讨32.5℃热激预处理、4℃低温预处理对游离小孢子胚胎发生的影响,为建立高效、完善的结球甘蓝小孢子培养技术体系提供理论依据。结果表明:32.5℃热激预处理48 h较适于诱导所有供试基因型小孢子胚胎的产生,在10份供试基因型中,基因型G10的每蕾出胚数最高,达到34.35个;单独的4℃低温预处理对诱导结球甘蓝小孢子胚胎发生无明显促进作用;4℃预处理与32.5℃预处理48 h的组合处理方式对诱导结球甘蓝小孢子胚胎发生的作用因基因型而异。

结球甘蓝小孢子胚胎发生的细胞学研究

游离小孢子培养即小孢子在外界胁迫诱导的条件下,从其配子体发育途径转向孢子体发育途径,诱导小孢子胚胎发生的过程。本研究通过对结球甘蓝小孢子胚胎发生的细胞学观察,为甘蓝游离小孢子培养中的可调控性及相关胚胎发育研究提供理论依据。选用3个在游离小孢子培养中胚胎发生响应有差异的甘蓝杂交种,分别采用醋酸洋红、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及荧光素双醋酸酯(FDA)3种染色方法,对甘蓝小孢子体内配子体发育、游离小孢子培养中的胚胎发生过程及细胞死亡现象进行了观察。结果表明:小孢子正常发育方向是单核小孢子经历2次不对称核分裂后发育成三核花粉,而单核靠边期小孢子在体外经32.5℃热激胁迫1 d后,小孢子绝大部分死亡,培养3 d后小孢子死亡率达到90%左右。结球甘蓝游离小孢子培养胚胎发生途径以B途径为主:第1次分裂为对称分裂,其后2个核进行反复分裂形成多细胞团,依次经历球型胚、心型胚、鱼雷胚,直至子叶胚的形成。除了以上典型B途径外,培养过程中还同时存在多种发育途径:第1次不对称分裂后,生殖核继续分裂即为A-G途径;营养核和生殖核两者同时继续分裂的A-VG途径。结论:甘蓝小孢子在体外经32.5℃热激胁迫1 d后,B途径为其主要孢子体发育途径;热激胁迫迅速诱导了小孢子的死亡。

秋季专用牛心甘蓝新品种锦秋55的选育

锦秋55是江苏省农业科学院蔬菜研究所利用游离小孢子培养技术选育的秋季专用牛心形早熟甘蓝新品种。该品种适宜我国南方地区秋季栽培,早熟,耐热,适应性好,抗黑腐病、病毒病等病害;叶球尖桃形,球形指数1.38左右,结球紧实,颜色绿,品质佳;单球质量1.3 kg左右,产量3 600 kg/667 m^2左右。

结球甘蓝耐裂球研究进展

综述了国内外结球甘蓝裂球性状及鉴定方法的研究进展,从裂球的遗传因素、叶片解剖特征、生理生化特性等方面分析了结球甘蓝裂球发生的原因,并提出了防治裂球的栽培措施。

甘蓝幼苗叶片超微结构及细胞内Ca^(2+)分布对低温的响应

探讨低温胁迫下甘蓝叶片细胞超微结构特征、细胞内Ca2+分布变化及品种间差异,为越冬甘蓝的耐寒性机理研究及耐寒品种选育提供理论依据。采用低温培养箱模拟逆境条件处理甘蓝幼苗,研究其对甘蓝叶片细胞超微结构及细胞内Ca2+分布的影响并比较了品种间差异。5℃低温处理时,甘蓝叶片大多数细胞器基本无损,排列有序,表明耐冷材料和冷敏材料均能适应5℃低温环境。在-3℃低温胁迫下,耐冷材料叶片超微结构破坏较小,而冷敏材料叶绿体结构破坏严重,基粒片层断裂、降解;线粒体多数扭曲变形,已无明显内脊。对照生长条件下(25/18℃),甘蓝幼苗叶肉细胞内Ca2+主要出现在液泡和细胞间隙中,细胞壁、细胞核中也有少量钙沉淀存在。在-3℃低温处理24 h后,耐冷材料细胞质和细胞核中的Ca2+浓度明显增加,冷敏材料细胞质中Ca2+也有增加,但较耐冷材料少。在低温处理24～72 h的过程中,耐冷材料细胞内增加的Ca2+浓度迅速降低,并恢复至处理前状态;而此阶段内冷敏材料因其细胞结构遭到严重破坏,细胞质中的Ca2+浓度升高到最大值后,无法恢复至稳定状态。低温胁迫下甘蓝叶片的超微结构特征及细胞内Ca2+行为特征表现显著差异,表明甘蓝叶片的超微结构特征及Ca2+分布变化与其抗寒性存在一定关系。

抗生素在甘蓝类蔬菜小孢子胚胎发生中的双重作用

为克服甘蓝类蔬菜游离小孢子培养中的细菌污染,以1个青花菜纯合系和2个结球甘蓝纯合系为试验材料,研究培养基中分别添加2种抗生素——头孢噻胯和羧苄青霉素对小孢子培养中细菌污染、胚胎发生和胚植株再生的影响。结果表明,2种抗生素的添加(25、50、100、200 mg·L^(-1))能够显著降低小孢子培养中的细菌污染;50 mg·L^(-1)头孢噻胯和羧苄青霉素的添加显著促进了结球甘蓝、青花菜胚胎发生和植株再生频率;抗生素处理高于50 mg·L^(-1)时,小孢子死亡率升高,同时小孢子的发育受到抑制。本研究报道了抗生素在小孢子培养中的双重作用,尤其是对于胚胎发生的促进作用,这对加快单倍体育种进程具有重要意义。

结球甘蓝游离小孢子热激处理下差异表达基因分析

[目的]本文旨在探讨结球甘蓝游离小孢子培养早期体胚发生的分子机制,分析游离小孢子在热激处理下的基因表达谱。[方法]将易出胚结球甘蓝高代自交系611单核靠边期小孢子分别在体外32.5℃培养1 d(热激处理,E2)、体内正常生长1 d(对照组1,E3)及体外25℃培养1 d(对照组2,E5),利用转录组测序技术(RNA-Seq)对3个处理的小孢子文库进行差异基因表达谱分析,并鉴定热激处理下早期体胚发生的响应基因。[结果]将3个处理的小孢子Uni Gene表达量依次进行两两相比,即E2 vs E3、E2 vs E5以及E3 vs E5,分别鉴定出2 506、1 073和3 322个差异表达基因。基因本体(gene ontology,GO)聚类分析表明,热激处理下的差异表达基因显著富集到细胞组分中的细胞部件、细胞及细胞器;在分子功能中,这些基因在结合、催化活性及核酸结合转录因子活性中的比例最高;在生物过程中的细胞过程、代谢过程及刺激反应等类别中的比例也最高。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析显示,热激处理下的差异表达基因显著富集到植物激素信号转导、植物病原互作、淀粉和糖代谢、抗坏血酸代谢、苯丙氨酸代谢以及多糖降解等途径。进一步对抗坏血酸代谢途径相关基因进行分析,抗坏血酸过氧化物酶基因APX1和APX2,半乳糖脱氢酶基因Gal DH以及乙醛脱氢酶基因AD在体外32.5℃培养1 d后均显著上调表达。[结论]通过转录组学方法揭示了结球甘蓝游离小孢子在热激处理下基因组的表达变化,鉴定了可能与早期体胚发生相关的抗坏血酸代谢途径基因,为进一步研究甘蓝小孢子体胚发生的分子机制奠定了基础。

甘蓝结球过程中内源激素含量与裂球性的关系

以4份耐裂球性不同的甘蓝高代自交系为试验材料,采用间接酶联免疫(ELISA)检测技术,对甘蓝结球过程中球叶中的生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)和脱落酸(ABA)4大类内源激素的含量和比值变化进行了分析,以探讨甘蓝裂球性与内源激素含量的关系。结果表明:在整个结球期,耐裂球材料各个时期的IAA、GA3含量均高于易裂球材料。ZR含量对甘蓝的裂球性影响不大。ABA含量在4种内源激素中含量值最大,而且耐裂球材料与易裂球材料间的动态差异较大。叶球生长后期(IAA+GA3+ZR)/ABA比值高可使叶球保持较高的生长势头,从而承受内部生长应力的能力较大,减少叶球开裂。

新型肥料对大蒜生长和品质的影响

为了减少大蒜生产中化学肥料施用量,达到科学施肥目的,分析了新型肥料对大蒜生长和品质的影响。以金乡白皮大蒜为试验材料,研究了常规追施尿素(CK)、大量元素水溶肥料(T1)、大量元素水溶肥料+有机叶面肥(T2)对大蒜植株生长势、蒜头产量及品质的影响。结果表明,大蒜株高、开展度、叶长、叶宽、叶片数、假茎高、游离氨基酸含量、可溶性糖含量及蔗糖含量均表现为T2>T1>CK;可溶性蛋白含量T2处理最大,而T1处理和CK相同;硝酸盐含量则表现为T2<T1<CK。与CK相比,T1、T2处理平均鲜蒜头质量较CK分别增加了12.89%和23.48%,平均干蒜头质量较CK分别增加了13.58%和27.25%。综上所述,施用大量元素水溶肥料和有机叶面肥增强了大蒜植株的生长势,显著增加了鲜蒜头和干蒜头产量,降低了鲜蒜头硝酸盐含量,提高了大蒜营养品质指标含量。从蒜头产量和品质的提升效果来看,T2处理效果最好,达到了减肥、增产及提高品质的目的。

鲜食加工兼用甘蓝新品种‘春秋秀美’的选育

‘春秋秀美’是以Ogura细胞质雄性不育系‘CMS411’为母本,以自交系‘364’为父本配制而成的杂交1代早熟甘蓝新品种。该品种叶球牛心形,球形指数春季约1.50,秋季约1.42;球形美观,球色绿,绿叶层平均9片;品质优,结球紧实,单球质量1.3 kg左右;耐抽薹性强,耐裂球,耐运输,耐根肿病。露地越冬春甘蓝栽培从定植到成熟约145 d,秋季栽培从定植到成熟约60 d,适宜江苏省及类似生态条件地区春、秋季栽培。2018年12月通过非主要农作物品种登记。

氮、磷、钾肥与有机肥配施对洋葱产量和品质的影响

为了解氮、磷、钾肥与有机肥配施对中日照类型洋葱(Allium cepa L.)生长势、产量和品质的影响,以中日照黄皮洋葱‘连葱4号’为试材,采用3次重复完全随机区组设计,设施用有机肥(M)配施氮、磷、钾肥的10个施肥处理,分别在植株生长盛期和采收期进行洋葱生长势、品质指标及产量的测定和分析。结果表明,氮、磷、钾肥配施有机肥能够提高洋葱叶绿素含量和根系活力,并且提高洋葱产量,其中叶绿素含量和产量受氮肥影响最为显著,根系活力受磷肥影响最为显著;氮、磷、钾肥配施有机肥能够提高洋葱的品质,其中维生素C和可溶性固形物含量受钾肥影响最为显著,可溶性糖含量受到磷肥和氮肥的显著影响。由此可见,氮磷钾肥配施有机肥能够提高洋葱产量和品质。

牛心甘蓝新品种探春的选育

探春母本410是由荷兰引进的资源C-32经多代自交选育出的自交不亲和系,父本423是由韩国心生(F1)与春丰(F1)杂交后,经系统选育而成的自交不亲和系。经品种试验和生产试验比较,该品种适宜我国长江流域地区作春、秋季栽培,露地越冬不易先期抽薹,早熟,叶球尖桃形,肉质脆嫩,品质佳,单球质量1.3 kg左右,每667 m2产量3 500 kg左右。

基于远缘杂交法的抗根肿病甘蓝新种质创制研究

以3份携带CRb基因的抗根肿病大白菜抗源CCR1、CCR2和CCR3为母本,与15份不同类型的甘蓝纯系进行远缘杂交,以获得抗根肿病甘蓝新种质。胚胎拯救法获得的平均成苗率分别是常规田间直接授粉的19.25倍、5倍和35倍。筛选出含有CRb基因的双二倍体,以CCR1、CCR2和CCR3为母本获得的种间杂种的自然加倍率分别为18.5%、48.3%和12.6%。对43株BC2单株进行遗传背景筛选等,表明单株17B14和17B15与甘蓝的遗传背景最为相近,且遗传背景与回交亲本甘蓝相似度更高,可用于下一步回交转育。通过远缘杂交及前景+背景选择快速获得抗根肿病甘蓝渐渗系,为甘蓝新品种的改良和培育提供了重要材料基础。