溶藻弧菌PEPCK蛋白原核表达及其乙酰化、琥珀酰化修饰的鉴定

构建溶藻弧菌HY9901 PEPCK蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并鉴定该蛋白的乙酰化及琥珀酰化修饰。采用PCR克隆pepck基因,构建pET-28a-pepck并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌株的培养温度、IPTG浓度及时间进行优化,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及乙酰化、琥珀酰化修饰。结果显示,pepck基因全长1 629 bp,重组菌株可以正确表达分子质量约60.9 kD的蛋白。诱导温度:在28℃条件下PEPCK存在于上清和包涵体中,在37℃则主要以包涵体形式存在;IPTG浓度:0.2 mmol/L-1.0 mmol/L范围内,PEPCK的表达量无明显差异;时间:在0-8 h内PEPCK表达量随时间增长逐渐增加,诱导8 h后趋于稳定。Western blot显示PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。成功构建溶藻弧菌PEPCK重组表达菌株,其最优诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG,28℃诱导8 h;经鉴定PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统C-环组分VscQ的原核表达及免疫原性

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901菌株Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)胞质环(C-环)组分VscQ作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌vscQ序列(NO.MN862753),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscQ基因,进行序列分析。结果显示,该基因全长969bp,预计分子量35.61kDa。将vscQ基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEXvscQ。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,能在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为61.6kDa的VscQ融合蛋白。VscQ蛋白表达的最优条件为:0.4mmol/L IPTG,15℃条件下诱导12h。用纯化后的VscQ融合蛋白免疫白兔,获得高效多克隆抗体,抗体效价为1∶121500。兔抗VscQ血清能与重组VscQ蛋白发生特异性反应,表明T3SS C-环组分VscQ可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。

去除杂色背景干扰的血指印提取一例

目的利用照相技术结合图像处理方法去除杂色背景干扰,加强血指印反差,为指印的提取提供技术参考。方法利用均匀照明技术对彩色半光滑表面上血指印进行配光检验,对提取指印进行图像加强反差处理,使指印具备检验鉴定条件。结果利用photoshop数字分色技术可以去除杂色背景干扰,加强血指印反差。结论现场指纹所在背景的颜色、影调深浅等干扰情形复杂,利用photoshop图像处理并非适用于各类颜色上的检材。使用通道的种类和背景颜色有密切关系,可选择和背景颜色相同或者相近的通道来加强反差。

溶藻弧菌T3SS exsD基因敲除突变株构建及其表型特征

【目的】构建溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)中的调控蛋白操纵子ExsD基因缺失株,研究exsD缺失株表型特征。【方法】采用overlapPCR技术构建缺失株ΔexsD,PCR检测缺失株ΔexsD的遗传稳定性,比较缺失株与野生株之间的生长速度、泳动能力、胞外酶活性、药物敏感性、毒力,分别采用结晶紫和共聚焦电镜方法测定生物膜的差异变化,通过qRT-PCR方法分析exsD的缺失对T3SS效应蛋白Hop转录的影响。【结果】缺失株ΔexsD构建成功;与野生株相比,ΔexsD遗传稳定性和生长速度无显著差别,但泳动能力极显著上升(P <0.01),胞外蛋白酶活性显著上升(P <0.05),形成生物膜能力在24 h时提高(P <0.05);相比野生株,ΔexsD对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、多西环素、新霉素的敏感性从耐药变成中度敏感;ΔexsD缺失株的毒力显著上升,野生株对斑马鱼的半数致死剂量是缺失株的3.68倍。实时荧光定量结果显示,与HY9901野生型相比,exsD基因的缺失增加了效应蛋白Hop的转录表达。【结论】exsD基因对T3SS的致病性起负调控作用,为进一步阐明exsD基因在溶藻弧菌中的作用机理提供一定的理论基础。