近零磁场下灰飞虱转录表达分析稳定性内参基因筛选

【背景】地磁场(geomagnetic field,GMF)并不是稳定不变的,其随时间和空间时刻变化。目前,随着对动物磁生物学研究的日益深入,基于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术开展的磁响应基因转录表达谱研究有力促进了磁响应通路的鉴定和磁感受机制的揭示。【目的】筛选近零磁场(near-zero magnetic field,NZMF)下短翅型灰飞虱(Laodelphax striatellus)稳定表达的内参基因,使对目的基因的定量分析更加准确。【方法】迁飞性昆虫灰飞虱采自江苏省农业科学院试验田并在室内使用TN1三叶期稻苗进行扩繁(温度:(25.0±1.0)℃,相对湿度:70%-90%,光周期:14L﹕10D)。采用亥姆霍兹线圈室内模拟近零磁场(NZMF;<500 nT)和地磁场(GMF;~50000 nT),人工模拟磁场强度有效处理空间为直径30 cm的球形空间,试验过程中严格控制除磁场强度外的环境因子(温度:(25.0±1.0)℃,相对湿度:75%,光周期:14L﹕10D)并利用磁通门计每日对人工模拟磁场进行校准和监测,灰飞虱连同TN1三叶期稻苗均置于试管中进行暴露处理,每隔两日与对照磁场中稻苗对调以避免稻苗潜在磁响应对灰飞虱的影响。利用Trizol法分别提取初羽化灰飞虱雌、雄成虫总RNA,检测各生物学重复RNA质量并调至含量一致,反转录为cDNA,利用qRT-PCR技术并结合常用内参筛选分析软件geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线综合分析系统RefFinder对在NZMF和GMF两种磁场强度下灰飞虱体内的内参基因稳定性进行评估筛选,其中,待评估的11个常用内参基因包括Actin1、Tubulin(α1TUB和α2TUB)、Elongation factor 1alpha(EF-1α)、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Ubiquitin(UBI)、Ribosomal protein S11(RPS11)、Ribosomal protein S15e(RPS15)、Ribosomal protein L8(RPL8)、Ribosomal protein L9(RPL9)和ADP ribosylation factor2(ARF2)。【结果】不同磁场环境(NZMF vs.GMF)下,灰飞虱短翅雌成虫EF-1α和RPL9表达稳定性在geNorm和NormFinder两种评估方法中都居于前两位,与BestKeeper软件的结果略有差异,进而利用在线工具RefFinder对以上3种方法的评估结果进行稳定性综合排序,结果表明EF-1α稳定性最好,RPL9稳定性次之;灰飞虱短翅雄成虫中,基于geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种评估方法,α2TUB和RPL9表达稳定性中均居于前两位,而Actin1表达稳定性虽在NormFinder和BestKeeper中处于前两位,但其在geNorm中稳定性较低,最后,通过在线工具RefFinder综合分析表明,α2TUB稳定性最好,RPL9稳定性次之。【结论】明确了不同磁场强度(NZMF vs.GMF)下适用于灰飞虱短翅雌、雄成虫中稳定表达的内参基因,其中,若使用双内参系统,雌成虫中可使用EF-1α和RPL9搭配,雄成虫中可使用α2TUB和RPL9搭配,为稳定表达的内参基因系统。此外,RPL9在灰飞虱短翅型雌、雄成虫中均可作为稳定的单一内参基因使用。研究结果确保了对灰飞虱响应磁场强度变化研究中关键目的基因转录表达的准确定量,并为今后开展磁场强度变化下的转录表达谱分析提供了有力保障。

北京市珍珠泉乡不同昆虫采集方法采集效果对比分析

为了探究科研调查中不同昆虫采集方法的采集效率差异,在北京珍珠泉乡不同的生境类型中,采用样线法、马氏网法、灯诱法、陷阱法(糖醋液)4种采集方法进行昆虫采集,按生境类型对不同采集方法采集的昆虫进行统计分析。在实验中共采集昆虫3996头,隶属12目87科,其中在昆虫种类数量上,鳞翅目最多,其次是半翅目和鞘翅目;在数量上,半翅目昆虫数量最多,依次是双翅目和鳞翅目。样线法共采集到昆虫61科72种、灯诱法共采集到45科95种、马氏网法共采集到39科41种、陷阱法共采集到14科25种。在调查中,不同方法在不同生境采集昆虫种类数多存在显著差异(P<0.05)。不同的采集方式间除马氏网和样线法采集昆虫的种类相似度为中等不相似(q=0.436),其他方法间均为极不相似。采用不同的采集方式可以采集到更多的昆虫种类。马氏网法是最优选的采集方式,马氏网采集昆虫最方便,节省人力;样线法采集的效果最稳定;灯诱法的采集效果好,但是应用较为复杂;糖醋液陷阱法采集昆虫效率对比其他三种方法,既不能采集到大量昆虫也没有采集到特定种昆虫,如无特别需求可以考虑减少或者放弃使用。

近零磁场对灰飞虱生长发育的影响

【目的】作为矢量场的地磁场(Geomagnetic field,GMF)不仅可为生物提供定向(定位)信息,并可能影响生物的进化。磁场强度的变化对生物生理、代谢和行为等可产生影响,本研究以迁飞性昆虫为模式生物,探究GMF强度变化对其生长发育的影响,进一步明确其对GMF强度变化的磁响应策略。【方法】以水稻迁飞性害虫灰飞虱Laodelphaxstriatellus为研究对象,利用亥姆霍兹线圈模拟近乎抵消GMF强度的近零磁场(Near-zeromagneticfield,NZMF),明确GMF强度缺失这一极端处理(NZMFvs.GMF)对灰飞虱生长发育的生物学效应。【结果】与GMF相比,NZMF显著延长了若虫历期(+8.23%)及雄成虫寿命(+35.60%)(P<0.05),显著缩短了雌成虫寿命(–17.68%)并显著降低了雌(–15.82%)雄(–15.21%)成虫体重(P<0.05),但NZMF对灰飞虱卵的发育历期影响不显著。【结论】相对于GMF对照,NZMF显著影响灰飞虱若虫和成虫的生长发育,且对灰飞虱成虫寿命的磁生物学效应表现出雌雄二型现象。

隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白相互作用及其在褐飞虱发育与生殖中的作用

【目的】在真核生物中验证隐花色素蛋白(Cryptochrome)/铁硫簇蛋白(Iron-sulfur cluster assembly1)的相互作用,研究2种蛋白在褐飞虱Nilaparvata lugens发育和生殖过程中的作用,为二者在磁感受机制中的协同作用及磁场对昆虫生理状态的调控机制提供依据和新的研究方向。【方法】通过酵母双杂交系统对褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白/Ⅱ隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白的相互作用进行验证。在褐飞虱3龄若虫和羽化第1天成虫中建立Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因RNAi(RNA interference)沉默模型,并采用RT-qPCR检测2个基因沉默效率,统计沉默虫体的若虫历期和产卵量。【结果】褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白存在相互作用,而Ⅱ隐花色素蛋白与铁硫簇蛋白不存在相互作用。褐飞虱3龄若虫和羽化第1天成虫中成功建立Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因RNAi沉默模型,在注射dsRNA后第2天、第4天和第6天时,2个基因的沉默效率均能达到70%以上。Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白基因沉默虫体的若虫历期无明显变化,但是产卵量受到显著性抑制。【结论】褐飞虱Ⅰ型隐花色素蛋白和铁硫簇蛋白存在相互作用,二者在褐飞虱生殖过程中发挥重要作用。