间充质干细胞源性外泌体对巨噬细胞的调节作用及应用

巨噬细胞是一种具有高度异质性和可塑性的免疫细胞,可在不同微环境下极化为促炎的M1型和抗炎的M2型,其极化状态的失调与多种疾病的形成和发展密切相关。间充质干细胞是一类具有自我更新和多项分化潜能的多能干细胞,其免疫调节特性受到了人们的广泛关注。外泌体作为间充质干细胞的旁分泌效应物,具有调节巨噬细胞的分化、趋化,分泌炎性因子和改善炎症微环境的能力,在疾病治疗中发挥重要作用。本文介绍了间充质干细胞源性外泌体调节巨噬细胞的机制,分析了其在疾病中的具体应用与应用前景,并认为间充质干细胞源性外泌体可通过其包含的生物活性物质调节巨噬细胞极化来发挥治疗作用。此外,通过预处理的方式改变间充质干细胞源性外泌体的生物学特性,可使其在不同的疾病中发挥理想的疗效。

肠道微生态研究方法及应用研究进展

肠道微生态是近些年来的研究热点,其为很多疾病提供了新的治疗思路,特别是在糖尿病、肥胖、慢性肾脏疾病以及其他肠道炎症疾病中。近年来对于肠道微生态的研究主要集中在三个方面,肠道微生物的多样性、功能及人工改造。针对各方面都有很多的研究方法,这些方法发展迅速,并且有着不同的特点,如何应用以得到合适的结果,这就需要对这些方法有足够的了解。

高糖对原代人脐静脉内皮细胞的损伤作用及机制研究

目的观察高浓度葡萄糖对原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)的损伤作用,并探讨其损伤机制。方法分别用低浓度葡萄糖(LG组,5.5 mmol/L)和高浓度葡萄糖(HG组,35 mmol/L)培养基培养HUVECs 24、72、120 h,胆囊收缩素八肽(CCK-8)检测高糖对HUVECs存活率影响,荧光探针检测细胞活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)水平,蛋白免疫印迹检测Bax、Bcl-2、沉默信息调节因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)和一氧化氮合酶(e NOS)的表达。结果 HG组处理72、120 h细胞存活率、Bcl-2均低于LG组,ROS水平、Bax和Bax/Bcl-2高于LG组,差异有统计学意义(P<0.05)。HG组处理HUVECs 24、72、120 h SIRT1和NO相对含量低于LG组,处理72、120 h e NOS低于LG组(P<0.05)。结论高糖可使HUVECs存活率下降,增强细胞内氧化应激反应,提高Bax/Bcl-2比值,可能与抑制SIRT1-e NOS通路使NO生成减少有关。

感染Ad-HGF对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

目的探讨高糖条件下感染携带肝细胞生长因子的重组腺病毒(Ad-HGF)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响。方法将HUVECs分为低糖组(LG组,5.5 mmol/L)、高糖组(HG组,35 mmol/L)、腺病毒对照组(HG+Ad-GFP组)和实验组(HG+Ad-HGF组)。检测4组HUVECs增殖情况、细胞内活性氧(ROS)水平及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达。结果 HG组、HG+Ad-GFP组HUVECs存活率低于LG组,HG+Ad-HGF组高于HG组(P<0.05,P<0.01)。HG组、HG+Ad-HGF组HUVECs内ROS水平高于LG组,但HG+Ad-HGF组低于HG组(P<0.05)。HG组、HG+Ad-GFP组Bax、Bax/Bcl-2高于LG组,Bcl-2低于LG组,但HG+Ad-HGF组Bax、Bax/Bcl-2低于HG组,Bcl-2高于HG组(P<0.05)。结论感染Ad-HGF可通过降低细胞内ROS水平和Bax/Bcl-2减少细胞凋亡,进而对高糖诱导的HUVECs起到保护作用。

SPK1调控人脐静脉内皮细胞SIRT1表达及细胞迁移的机制研究

目的探讨鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1,SPK1)调控沉默信息调节因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)表达及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)迁移能力的机制。方法用病毒感染复数(MOI)=20的p LKO.1-sh SPK1-GFP干涉慢病毒(sh SPK1组)和p PIG-U6-Scramble-GFP对照慢病毒(GFP-SC组)感染HUVECs,48 h后提取细胞蛋白并用蛋白免疫印迹法检测ERK、P38 MAPK及AKT磷酸化水平。分别用PD98059、SB203580及Wortmannin处理HUVECs 1 h,检测ERK、P38 MAPK及AKT信号表达及SIRT1蛋白表达情况。取抑制剂干预后的细胞进行Transwell小室迁移实验,检测细胞迁移能力。结果sh SPK1组ERK、P38 MAPK及AKT的磷酸化水平均低于GFP-SC组(P<0.05,P<0.01)。PD98059、SB203580及Wortmannin组ERK、P38 MAPK、AKT磷酸化水平及SIRT1蛋白表达水平低于对照组,HUVECs的迁移能力较对照组弱(P<0.01)。结论 SPK1可以通过ERK、P38 MAPK及AKT通路调控HUVECs SIRT1的表达及迁移能力。

鞘氨醇激酶1调控沉默信息调节因子1表达的研究

目的探讨鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1,SPK1)与沉默信息调节因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)表达的关系。方法用病毒感染复数(MOI)=20 p LKO.1-sh SPK1-GFP干涉慢病毒(sh SPK1组)及p PIG-U6-Scramble-GFP对照慢病毒(GFP-SC组)感染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),48 h后提取细胞RNA及蛋白,实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western Blot)测定SIRT1基因及蛋白表达水平。用MOI=20 p HIV7-U6-sh SIRT1-RFP干涉慢病毒(sh SIRT1组)及p HIV7-U6-Scramble-RFP对照慢病毒(RFP-SC组)感染HUVECs,48 h后提取细胞RNA并用RT-PCR检测细胞SPK1基因表达水平。用100 nmol 1-磷酸鞘氨醇(S1P)处理HUVECs,分别在0.5、2、24及36 h提取细胞RNA,24、48及72 h提取细胞蛋白,检测SIRT1基因及蛋白表达水平。用100 nmol S1P处理干涉过SIRT1的HUVECs检测细胞的增殖、迁移及体外管状结构形成能力。结果 sh SPK1组SIRT1基因和蛋白表达水平低于GFP-SC组(P<0.01)。sh SIRT1组SPK1基因表达水平与RFP-SC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。100 nmol S1P处理HUVECs不同时间SIRT1基因及蛋白表达水平高于未处理组,HUVECs增殖能力高于sh SIRT1组(P<0.05,P<0.01)。sh SIRT1组HUVECs迁移率低于RFP-SC组,S1P处理组高于RFP-SC、sh SIRT1组(P<0.05)。sh SIRT1组HUVECs体外管状结构形成能力低于RFP-SC组,S1P处理组高于sh SIRT1组(P<0.05)。结论 SPK1可以正向调控SIRT1表达并对HUVECs功能产生影响。

基于肝细胞生长因子的基因疗法在缺血性疾病中的应用研究进展

随着分子生物学的不断发展,基因治疗已被作为治疗各种心血管疾病新的策略之一,在这一领域用基因疗法主要是针对局部缺血性疾病如心肌梗死、心绞痛与外周动脉疾病等。该类患者大部分是由于患者的解剖特点和动脉闭塞症使患者不适合手术或经皮血管重建。因此,这类疾病往往疗效较差。然而针对严重的心脏缺血和关键的肢体缺血尚无最佳的治疗药物。

糖尿病的发生与免疫指标的相关性研究

【目的】观察在糖尿病发生过程中体液免疫与细胞免疫的相关性.【方法】通过高脂饮食来制备小鼠前期糖尿病(Pre-DM)模型,及高脂饮食联合小剂量多次注射链脲佐菌素(STZ)制备小鼠Ⅱ型糖尿病(T2DM)模型.将80只C57BL/6J试验小鼠随机分为4组:根据预试验结果,饲喂高糖高脂饮食,选取0 d(A组)、40 d(B组)、80 d的(C组),为Pre-DM组;在80 d之后用高脂饲喂联合小剂量多次注射STZ制备T2DM模型组(D组).进行空腹血糖腹腔注射糖耐量实验(IPGTT);测定相关血清生化指标,用ELISA法测定胰岛素水平及免疫指标.用比浊法作hs-CRP,应用流式细胞术检测CD_3^+、CD_3^+CD_8^+、CD_3^+CD_4^+等T淋巴细胞亚群的比例.【结果】IPGTT结果显示,D组与其他3组曲线下面积差异极显著(P<0.01).A～D组血糖存在依次上升趋势,组间均有显著差异(P<0.05),与糖尿病相关的生化指标组间均有差异性(P<0.05),CD_3^+CD_8^+与CD_3^+CD_4^+组间差异均显著(P<0.05),CD_3^+A组与D组的差异显著(P<0.05),其余各组间差异不显著(P>0.05).HE染色结果发现,T2DM的发生过程会伴随器官的损伤.【结论】Pre-DM模型组已经存在胰岛素抵抗与胰岛受损,且伴随着肝脏不同程度的损伤;Pre-DM模型组相关的免疫指标异常及T淋巴细胞亚群的比例失衡与T2DM的发生风险有一定的相关性.

游离脂肪酸致胰岛素抵抗的分子机制

胰岛素抵抗(IR)是与2型糖尿病(T2DM)、高血压、血脂紊乱等疾病有关的一种复杂的代谢紊乱性疾病,这些与IR相关的疾病均是心血管疾病的独立性危险因素。脂代谢紊乱对细胞具有脂毒性作用,会引起或加重IR,其典型表现是血浆甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平升高,其中血浆FFA升高是IR的独立致病因素。虽然FFA导致IR的具体机制还不完全清楚,但已证实FFA可通过内质网应激、氧化应激作用、凋亡和炎症作用等引发IR。本文概述了参与这些致病过程的相关分子及其作用机制,为FFA导致IR的致病机制研究提供理论依据,同时为临床治疗IR和预防T2DM提供参考。

游离脂肪酸致胰岛素抵抗的相关分子机制研究进展

胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）是与2型糖尿病（T2DM）的发生紧密相关的一种代谢性疾病,T2DM是导致心脑血管疾病的独立危险因素,给个人、家庭和社会带来了沉重的负担。在导致IR的发病因素中,游离脂肪酸（free fatty acids,FFAs）被证实是与肥胖相关的IR的重要致病因素。因此了解FFAs导致IR的机制,并了解其中的重要分子机制,

重组腺病毒对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞一氧化氮生成的影响及机制

目的观察感染携带肝细胞生长因子的重组腺病毒(Ad-HGF)对高糖诱导的原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)一氧化氮(NO)生成的影响,并探究其机制。方法将HUVECs分为低糖组(LG组)、高糖组(HG组)、腺病毒对照组(HG+Ad-GFP组)和实验组(HG+Ad-HGF组),感染48 h后,采用NO荧光探针检测细胞内NO水平,蛋白免疫印迹法(Westren Blot)分别检测各组细胞鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1,SPHK1)、沉默信息调节因子2相关酶类1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial ntric oxide synthase,e NOS)蛋白表达。结果 HG组HUVECs细胞内NO水平及SIRT1和e NOS蛋白表达水平低于LG组,HG+Ad-HGF组高于HG组(P<0.05),但4组间SPHK1表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Ad-HGF可通过激活SIRT1-e NOS-NO通路保护HUVECs免受高糖损伤。

一种便携式无活细胞表达的生物合成新技术及其应用

1生物合成新技术概述 合成生物学将工程设计原则合理地应用于分子生物学、新的基因装置设计,在疾病的诊断和治疗的领域发挥作用[1],如,创建全细胞生物传感器[2],基因修饰益生菌[3]以及细胞生物分子加工厂。源自基因工程的生产细胞系基础上,生物合成已成为药品生产[4]、蛋白质疗法[5]、燃料及其他产品[6]的主流技术。

肠源性氧化三甲胺在慢性肾病中的作用

氧化三甲胺是由人体正常消化产生并进入血液中的一种物质,一直以来被认为是正常的血液循环物质。但是近年来研究发现,氧化三甲胺具有生物活性,对多种慢性疾病都会产生不利影响。氧化三甲胺的产生主要依靠肠道菌群的代谢。在慢性肾脏疾病中,很多原因可导致肠道菌群发生改变,并且可以代谢生成氧化三甲胺的菌群种类明显升高,这就使慢性肾脏病患者血液中的氧化三甲胺含量上升。由于氧化三甲胺主要通过肾脏排泄,肾脏功能障碍可造成其在体内的积累,从而加剧慢性肾脏病患者的肾脏损伤。

胃癌患者外周血内皮祖细胞检测及临床意义

目的探讨外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)水平与胃癌临床指标的相关性。方法 55例胃癌患者为胃癌组,44例慢性胃炎患者为胃炎组,46例体检健康者为对照组。采用流式细胞仪计数3组外周血EPCs数量,分析外周血EPCs数量与胃癌患者年龄、性别、TNM分期及肿瘤分化程度等临床指标的相关性。结果胃癌组患者外周血EPCs数量[(20.20±13.90)个/mL]明显高于胃炎组[(6.00±2.80)个/mL]和对照组[(4.10±2.60)个/mL](P<0.01),胃炎组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);胃癌组中,年龄≤57岁患者外周血EPCs数量[(24.00±16.70)个/mL]高于>57岁患者[(15.00±9.40)个/mL](P<0.05),TNM分期Ⅲ、Ⅳ期患者外周血EPC数量[(29.36±14.48)、(33.33±18.92)个/mL]高于Ⅰ、Ⅱ期患者[(12.67±6.70)、(15.17±9.24)个/mL](P<0.01),低分化胃癌患者外周血EPC数量[(27.72±15.02)个/mL]高于中、高分化患者[(14.63±12.07)、(13.73±8.11)个/mL](P<0.01);男性患者外周血EPCs数量[(19.00±8.40)个/mL]与女性[(21.00±13.60)个/mL]比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论胃癌患者外周血EPCs数量增加,与年龄和疾病进展相关,可作为胃癌临床诊断、分期及预后判断的生物标志物。

携带低氧诱导因子-1α及角质细胞生长因子的减毒沙门菌TPHK的构建及其在低氧应激大鼠胃肠组织中的表达

目的构建携带低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)的减毒沙门菌TPHK,并检测其在低氧应激大鼠胃肠组织中的表达。方法从质粒p IRES-KGF中PCR扩增获得KGF基因片段,经双酶切回收后,与p IRES-HIF质粒进行连接,获得双基因重组质粒p IRES-HIF-KGF,Ca Cl2法转化减毒沙门菌Ty21a,获得重组菌株TPHK。将TPHK菌液灌胃给予大鼠,10~9 cfu/(只·d),饲养7 d后,置模拟海拔6 000 m的高原低氧舱,舱内连续饲养7 d,采集大鼠胃及小肠组织,ELISA法检测HIF-1α及KGF的表达水平。结果重组质粒p IRES-HIF-KGF及重组菌株TPHK经双酶切及测序鉴定证明构建正确。给予TPHK菌液后可明显提高低氧应激大鼠胃及肠组织中HIF-1α及KGF的表达水平(P<0.001)。结论成功构建了携带HIF-1α及KGF的减毒沙门菌TPHK,且其可提高HIF-1α及KGF在低氧应激大鼠胃肠组织中的表达。

肠道微生态将有可能成为治疗免疫性疾病的新靶点

1972年生物学家托马斯·莱克首次得出人体内的细胞与微生物的比值约为1∶10,这是国际医学首次量化人体内细胞与微生物的数量。近年来,随着研究的深入,越来越多的研究表明肠道微生态与人类的健康息息相关。人体内的微生物主要寄居在口腔与肠道内,约有1000-2000种。

角质细胞生长因子联合低氧诱导因子1α对低氧应激大鼠小肠隐窝上皮细胞的保护作用及其机制

目的探讨角质细胞生长因子(KGF)联合低氧诱导因子1α(HIF-1α)对低氧应激大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)的保护作用及其机制。方法(1)取常规培养大鼠IEC-6细胞,根据随机数字表法分为常氧空白组、常氧KGF组、常氧HIF-1α组和常氧联合组,分别更换DMEM培养基、含0.5ng/mLKGF培养基、含10.0ng/mLHIF-1α培养基及同时含0.5ng/mLKGF和30.0ng/mLHIF-1α培养基,放入氧气体积分数为21%的细胞培养箱培养24h。(2)另取常规培养大鼠IEC-6细胞,根据随机数字表法分为常氧对照组、低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组。常氧对照组细胞更换DMEM培养基,并常规培养24h;低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组细胞分别更换DMEM培养基、含0.5ng/mLKGF培养基、含10.0ng/mLHIF-1α培养基及同时含0.5ng/mLKGF和30.0ng/mLHIF-1α培养基,并置于氧气体积分数为5%的三气培养箱中低氧培养24h。取常氧及低氧处理各组细胞,样本数为3,光学显微镜下观察细胞形态学变化。取常氧及低氧处理各组细胞,样本数为3,细胞计数试剂盒8检测细胞存活率。取常氧对照及低氧处理各组细胞,样本数为3,流式细胞仪检测细胞周期变化及凋亡水平,紫外分光光度计和蛋白质印迹法分别检测细胞ATP含量和p53蛋白表达水平。对数据行单因素方差分析及LSD检验。结果(1)培养24h后,常氧处理各组细胞均生长良好,细胞呈圆形或椭圆形,胞质清晰;低氧处理各组细胞均出现梭形、星形等不规则形态,胞质有黑色颗粒沉着。(2)培养24h后,常氧空白组、常氧KGF组、常氧HIF-1α组及常氧联合组细胞存活率分别为(107.4±8.7)%、(109.8±2.9)%、(115.8±7.4)%、(112.8±10.6)%,组间总体比较,差异无统计学意义(F=0.685,P=0.586)。培养24h后,低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组细胞存活率分别为(35.1±4.6)%、(52.9±6.8)%、(56.2±3.1)%、(71.2±9.6)%,均显著低于常氧对照组的(106.3±12.3)%,P<0.001。低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组细胞存活率均明显高于低氧对照组(P=0.023、0.009、<0.001),低氧联合组细胞存活率明显高于低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.017、0.045)。(3)培养24h后,低氧对照组G1期细胞百分比显著高于常氧对照组(P=0.030),低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组S期细胞百分比显著低于常氧对照组(P=0.020、0.031、0.026),其余各组各期细胞百分比与常氧对照组相近(P=0.516、0.107、0.052、0.985、0.637、0.465、0.314、0.591)。培养24h后,低氧对照组、低氧KGF组及低氧HIF-1α组G1期细胞百分比明显高于低氧联合组(P=0.001、0.030、0.014),且S期细胞百分比显著低于低氧联合组(P=0.001、0.012、0.010)。(4)培养24h后,与常氧对照组比较,低氧对照组细胞凋亡率明显升高(P=0.018),低氧联合组细胞凋亡率明显降低(P=0.008)。培养24h后,与低氧对照组比较,低氧KGF组和低氧联合组细胞凋亡率明显降低(P=0.004、0.001);低氧联合组细胞凋亡率明显低于低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.032、0.002)。(5)培养24h后,与常氧对照组比较,低氧联合组细胞ATP含量无明显变化(P=0.209),其余各组细胞ATP含量均明显降低(P=<0.001、0.001、0.002);与低氧对照组比较,低氧HIF-1α组和低氧联合组细胞ATP含量明显升高(P=0.044、0.001);低氧联合组细胞ATP含量明显高于低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.011、0.020)。(6)培养24h后,与常氧对照组比较,低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组细胞p53蛋白表达量明显升高(P<0.001),低氧联合组细胞p53蛋白表达量显著低于低氧对照组、低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.001、0.001、0.002)。结论KGF联合HIF-1α对低氧应激大鼠IEC-6细胞具有显著的保护作用,可通过降低其细胞周期阻滞程度及凋亡水平,提高细胞的能量代谢水平,从而促进低氧环境下细胞的存活。