犬血管内皮细胞的高效分离与培养方法的建立

为了建立一种自主分离原代犬血管内皮细胞(vein endothelial cell,VEC)的新方法,试验将无菌分离的犬降主动脉由内向外翻转后,放入0.075%的Ⅰ型胶原酶中消化15 min,然后轻刮血管内表面,加入0.1%的Ⅰ型胶原酶消化4 min;经内皮细胞培养基(endothelial cell medium,ECM)重悬细胞并贴壁培养24 h后,对特征细胞进行准确标记,刮除其他干扰细胞,快速消化特征细胞集落并扩大培养,得到原代细胞;对原代细胞进行形态观察、生长特性分析,以及细胞表面标志物鉴定(免疫荧光法和PCR法)和细胞纯度分析。结果表明:原代细胞培养24 h后,在倒置显微镜下可见散在的、成群分布的“鹅卵石”状或“铺路石”状细胞。不同代次细胞生长曲线均呈典型的“S”型;P3细胞(传代至第3代的细胞)、P6细胞(传代至第6代的细胞)的增殖活性比P8细胞(传代至第8代的细胞)强。分离纯化后的细胞经免疫荧光法及PCR法鉴定发现,内皮细胞表面标志物——血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)、造血祖细胞抗原CD34、血管性血友病因子(vWF)、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮钙黏蛋白(VE-Cadherin)呈阳性表达;其中,阳性表达CD31的细胞占比为(94.22±1.87)%,阳性表达造血祖细胞抗原CD34的细胞占比为(96.24±1.09)%。说明本试验通过准确标记细胞、清除干扰细胞并快速消化所需细胞,得到1株纯度高且具备稳定生长特性的原代犬VEC系,操作切实有效,可重复性高,为VEC的高效分离与培养提供了一种简便的方法。