CD46基因在新疆褐牛不同组织中的表达研究

为了探究CD46基因在新疆褐牛不同组织中的表达丰度差异,初步掌握CD46基因在新疆褐牛不同组织中的表达规律,试验设计了特异性引物,应用实时荧光定量PCR技术分析新疆褐牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、大肠、胃、肌肉、卵巢和乳腺中的CD46基因表达情况。结果表明,新疆褐牛CD46基因在所检测的11种组织中均有表达,不同组织部位的表达存在差异,其中肝脏CD46表达丰度最高,其表达丰度显著高于肺脏、脾脏、肾脏、胃、小肠、大肠、卵巢和乳腺(P<0.05)。本研究对新疆褐牛各组织CD46基因的表达规律进行初步分析,为CD46基因表达规律与其生物功能研究的开展提供了参考依据。

牛病毒性腹泻病毒感染对CD46基因修饰树突状细胞表型及其细胞因子分泌的影响

为研究CD46分子在BVDV感染树突状细胞(DC)介导的免疫应答中的作用,本研究根据牛CD46基因保守序列设计3对短发卡RNA(shRNA)的正义、反义寡核苷酸链,以及3对乱序列作为阴性对照,将其退火后分别克隆至p LL3.7质粒载体中,获得CD46基因shRNA重组质粒后将其转染MDBK细胞。采用荧光定量PCR和western blot技术筛选最佳沉默CD46基因的shRNA重组质粒,将其和表达载体p VAX1-CD46转染新疆褐牛DC(MDDCs)后利用BVDV感染MDDCs,通过荧光定量PCR检测DC表型及其细胞因子mRNA转录水平。结果显示,与未转染细胞组相比,CD46基因过表达的MDDCs中CD40、CD80、CD86和MHC-II的mRNA转录水平均明显升高(p<0.05);而CD46基因沉默的MDDCs中CD40 mRNA转录水平也明显升高(p<0.05),CD86 mRNA转录水平变化不明显(p>0.05),CD80和MHC-II的mRNA转录水平均明显下降(p<0.05)。与未转染细胞组相比,CD46基因过表达组IL-10和IL-12 mRNA转录水平变化不明显(p>0.05),而CD46基因沉默的MDDCs中IL-10和IL-12 mRNA的表达均明显下降(p<0.05)。本研究从新的角度初步揭示了CD46分子对BVDV感染DC成熟、初始T细胞增殖和分化的影响,为解决DCs对BVDV的免疫抑制作用提供新的思路。

新疆褐牛CD46基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

旨在克隆并表达新疆褐牛CD46基因,制备其多克隆抗体,为进一步研究牛CD46分子生物学功能奠定基础。采用RT-PCR方法从新疆褐牛脾脏中扩增CD46基因全长,进行测序,并对测序结果进行生物信息学分析,将CD46部分序列亚克隆于pET-28a(+)和pVAX1载体中。将阳性重组质粒pET-28a-△CD46转化于E.coli Rosetta-gamiB(DE3)感受态细胞,诱导表达截短CD46蛋白。用切胶纯化的His-△CD46融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;采用ELISA测定多克隆抗体的效价;取无内毒素重组质粒pVAX1-△CD46转入BHK-21(仓鼠肾细胞)细胞,表达产物以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测该多克隆抗体的特异性。CD46基因的测序结果表明,部分基因蛋白表达、纯化条带大小与预期一致;制备的抗牛CD46多克隆抗体效价高于1∶128 000,并具有良好的特异性。