中国南海来源真菌Penicillium sp.SCSIO 40438次级代谢产物研究

本论文对中国南海来源真菌Penicillium sp.SCSIO 40438的次级代谢产物进行了研究。通过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及高效液相色谱等多种分离方法对该菌株的发酵产物进行了分离纯化,并利用核磁共振和高分辨质谱等波谱学方法对分离得到的化合物进行了结构鉴定。从中共分离鉴定到9个化合物:1-(2-Methylbut-3-en-2-yl)-1H-indole-3-carbaldehyde(1)、1-methyl-2(1H)-quinazolinone(2)、fructigenine A(3)、fructigenine B(4)、2-[(s)-hydroxy(phenyl)methyl]-3-methylquinazolin-4(3H)-one(5)、3-methylviridicatin(6)、3-O-methylviridicatol(7)、viridicatol(8)和(+)-cyclopenol(9)。其中,化合物1和2为新天然产物。抑菌活性实验表明,化合物8具有中等强度的抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性,最低抑菌浓度为8.0μg·mL^(-1)。

11种中药乙醇提取物抗甲真菌作用研究

采用固体琼脂稀释法体外观察11种中药的乙醇(体积分数为75%)提取物对白色念珠菌、Fh6和W13株致甲真菌病真菌的作用,以筛选出抗菌作用较强的单味中药.结果表明6种中药乙醇提取物对1种或几种甲真菌显示较强的抑制作用,其中蛇床子、牡丹皮的乙醇提取物对3种甲真菌均有较强的抑制作用.

海洋微生物次级代谢产物生物合成的研究进展

海洋微生物次级代谢产物往往具有新颖的化学结构,蕴含着独特的生物合成途径、酶学机理和不同于陆生放线菌次级代谢产物的生物合成机制。自从2000年第一例海洋微生物天然产物enterocin的生物合成基因簇被阐明以来,迄今已克隆和鉴定了27种海洋微生物次级代谢产物的完整生物合成基因簇。这些次级代谢产物的生物合成主要源于四种途径,包括聚酮合酶途径,非核糖体肽合成酶途径,聚酮-非核糖体肽合成酶杂合途径,以及其他途径。本文综述了近年来一些重要海洋微生物活性次级代谢产物的生物合成途径,以及组合生物合成技术在海洋微生物次级代谢产物结构多样化方面的应用。

海洋来源小单孢菌MicromonosporarosariaSCSION160中大环内酯类化合物的分离鉴定

放线菌SCSIO N160是从南海海底沉积物中分离到的一株小单孢菌。从Micromonospora rosaria SCSIO N160的发酵液中,我们分离纯化了四个大环内酯类抗生素,通过质谱与核磁共振1H、13C NMR谱的解析,确定为rosamicin(1)、6108B(2)、M-4365 A1(3)和M4365-G1(4)。

原发性十二指肠恶性肿瘤25例分析

原发于十二指肠的恶性肿瘤临床上较少见,往往因缺乏典型的临床表现而延误诊断和治疗。我院1983年至1991年收治了原发性十二指肠恶性肿瘤25例,现报告如下。临床资料一般资料男性18例,女性7例,年龄31岁至74岁,平均51.7岁,40岁以上者19例,症状出现距入院时间10天至3年,平均5个月左右。手术死亡1人。全部病例均经手术和病理组织学证实,其中术前确诊13例。临床表现(见表1)

海洋微生物次生代谢的生物合成机制

海洋微生物,日益成为新颖次级代谢产物发现的理想资源。该课题在前期研究基础的基础上,继续进行抗菌、抗肿瘤和抗污损等结构新颖、活性独特的次级代谢产物的挖掘,同时开展这些化合物的生物合成机制研究,揭示酶学机理,提出次级代谢产物生物合成途径的分子和化学模型,进而利用组合生物学技术扩展其结构多样性,为获得具有自主知识产权的创新药物提供物质基础。

提取致病丝状真菌的DNA的简便方法

目的找到一种合适简便的致病丝状真菌的DNA提取方法。方法 用3种DNA提取方法分别提取2种致病的丝状真菌的DNA,比较提取的DNA的产物质量和纯度,找出简便合适的方法。结果改进的氯化苄法提取的2种真菌的DNA的质量在3种方法中都是最高的,分别达到2.925mg/mL和2.763mg/mL,改进的氯化苄法提取的DNA没有降解,质量和产量较高,纯度也是较好的。提取产物可适用于各种分子生物学实验。结论 改进的氯化苄法是一种适用于致病丝状真菌DNA提取的简便方法。

苏云金芽胞杆菌质粒p26复制功能区的克隆

利用特异引物从基因组BAC文库筛选到1个35kb的片段,对该片段测序比对分析发现可能含有p26的复制区。为了验证该片段中是否含有p26的复制区,首先,将大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT304用EcoRⅠ酶切切掉苏云金芽胞杆菌复制子后自连,获得复制子克隆载体pHT304E;随后,将12kbEcoRⅠ片段亚克隆到载体pHT304E上电转化无晶体突变株BMB171,获得具有抗性的转化子,证明该片段具有复制功能。缺失实验证明最小复制功能区包含2个必需的ORF。经过40代无抗培养,最小复制区复制稳定性达到90%以上。

苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB28的克隆

苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020具有典型的晶胞粘连表型。在前期的研究中,通过质粒消除实验,推测晶胞粘连现象与YBT-020内生质粒pBMB28有关。为了定位质粒pBMB28上控制晶胞粘连表型的基因,首先对质粒pBMB28进行克隆。利用穿梭载体pEMB0557,成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-020的基因组人工染色体(BAC)文库。前期的研究表明晶体蛋白基因cry28Aa定位在质粒pBMB28上,根据cry28Aa基因序列设计引物,从文库中筛选到含有cry28Aa的重组质粒pBMB231。镜检和SDS-PAGE证明质粒pBMB231转化无晶体突变株BMB171形成的重组子BMB231可以产生Cry28Aa晶体蛋白,但不能恢复晶胞粘连表型。对重组质粒pBMB231的插入片段末端序列测定并设计引物筛选文库,通过染色体步移方式得到4个可以重叠覆盖质粒pBMB28不同区域的克隆子,从而克隆了该质粒。对这4个克隆子末端测序和酶切分析,测算出该质粒的大小约为140 kb。进一步确定应用基因组BAC文库以及重叠片段筛选的方法,可以快速有效的克隆苏云金芽胞杆菌大质粒。

10组抗菌药物对耐药伤寒的疗效观察

对以M_1型为优势的耐氯霉素等抗菌药物的伤寒菌株引起的220例伤寒患者进行了药物治疗观察,发现氟哌酸、氟哌酸与甲氧苄氨嘧啶、氟哌酸与庆大霉素联台治疗组的疗效优于氯霉素或含氯霉素的联合治疗组。采用氟哌酸治疗无严重全身毒副反应,未见复燃或复发病例,费用亦经济。一般病例单用氟哌酸即可,重症病例可与其他抗菌药物联合治疗。在广泛存在耐药菌株流行的情况下,应首选氟哌酸治疗伤寒。

伤寒的嗜酸性粒细胞动态变化与临床关系观察

伤寒的嗜酸性粒细胞动态变化与临床关系观察宝应县卫生局殷友成宝应县射阳医院朱义广，丁春华江苏省人民医院屠聿修宝应县人民医院马云仙几年前，我省伤寒流行较为严重，且表现病情重，并发症多，复发率高，耐氯霉素等。在伤寒的整个病程中，嗜酸性粒细胞（Ｅｏｓｉｎｏｐ...

永兴岛白穗软珊瑚共附生放线菌筛选及部分活性次级代谢产物的鉴定

【目的】从白穗软珊瑚中分离和鉴定共附生放线菌,运用PCR技术对所分离的放线菌进行I型聚酮合酶(PKS)筛选,研究其次级代谢产物。【方法】使用11种培养基对白穗软珊瑚共附生放线菌进行分离、鉴定,构建16S rRNA基因系统发育进化树,以基于I型PKS的KS基因设计的简并引物对所分离放线菌进行基因筛选,对阳性菌株用3种培养基发酵检测,对目标菌株进行放大规模发酵分离鉴定次级代谢产物。【结果】从白穗软珊瑚中分离到20株共附生放线菌,包括链霉菌属10株、迪茨氏菌属2株和盐水孢菌属8株,筛选获得18株I型PKS阳性菌株,并从菌株Salinospora arenicola SH04中分离到化合物rifamycin S和rifamycin W。【结论】首次从珊瑚共附生环境中分离得到海洋专属性稀有放线菌盐水孢菌属,并以I型PKS基因筛选为指导,分离鉴定了聚酮类化合物rifamycins,为研究软珊瑚共附生可培养放线菌的多样性和基于基因筛选指导分离次级代谢产物提供了可靠依据。

友菌素核苷转移酶amiE基因的克隆、表达和功能鉴定

【目的】克隆和表达二糖核苷类抗生素友菌素生物合成基因簇中的核苷转移酶基因amiE,并研究AmiE的体外催化功能。【方法】采用PCR技术将编码257个氨基酸的葡萄糖-1-磷酸核苷转移酶基因amiE克隆到表达载体pET28a上,构建质粒pCSG4001,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达;利用亲和层析分离纯化蛋白AmiE,以葡萄糖-1-磷酸和胸腺嘧啶三磷酸(TTP)或尿嘧啶三磷酸(UTP)为底物,利用高效液相检测AmiE的体外酶活;以甘露糖-1-磷酸、半乳糖胺-1-磷酸和半乳糖-1-磷酸和TTP作为底物,进一步研究AmiE对底物的选择性。【结果】N-末端融合组氨酸标签的AmiE蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,通过亲和层析纯化出的AmiE能够以TTP(或UTP)和葡萄糖-1-磷酸作为底物,催化形成胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖(TDP-glucose)或者尿嘧啶二磷酸葡萄糖(UDP-glucose),但对其他三种底物,无明显催化活性。【结论】大肠杆菌中表达纯化的核苷转移酶AmiE能够体外催化形成TDP-葡萄糖(或UDP-葡萄糖),确证了AmiE作为核苷转移酶的催化功能,同时表明AmiE对底物具有一定的选择性。

PPtase高表达海洋放线菌Streptomyces sp.SCSIO 40060的次级代谢产物研究

目的对1株南海沉积物来源的PPtase高表达放线菌Streptomyces sp.SCSIO 40060进行次级代谢产物研究。方法利用硅胶柱色谱、薄层色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱和高效液相色谱(HPLC)等手段对PPtase高表达菌株发酵产物进行分离纯化;运用核磁共振(NMR)、质谱(MS)等波谱方法,并结合相关文献数据比对,鉴定化合物的结构。结果从PPtase高表达菌株发酵产物中分离纯化得到7个化合物,包括5个二酮哌嗪类化合物、1个萘醌衍生物和1个萘甲酸衍生物,分别为methoxyneihumicin(1)、XR334(2)、(S,Z)-3-benzylidene-6-isopropylpiperazine-2,5-dione(3)、(S,Z)-3-benzylidene-6-methylpiperazine-2,5-dione(4)、(3Z,6Z)-3-(4-methoxybenzylidene)-6-(2-methylpropylidene)-piperazine-2,5-dione(5)、2-methoxy-1,4-naphthoquinone(6)、1-hydroxy-4-methoxy-2-naphthoic acid(7)。

珠江口沉积物来源链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的鉴定及其生物合成基因簇的异源表达

【目的】从珠江口沉积物来源的菌株SCSIO 40020中分离bafilomycins,并对其生物合成基因簇进行克隆和异源表达研究。【方法】通过分析菌株SCSIO 40020的16S rRNA基因序列并构建系统发育树以鉴定菌种,以柱层析法和制备色谱法对次级代谢产物进行分离纯化,借助波谱学手段完成单体化合物的结构鉴定,采用生物信息学分析定位bafilomycins的生物合成基因簇,通过筛选菌株SCSIO 40020基因组的细菌人工染色体文库和接合转移将bafilomycins生物合成基因簇导入3种链霉菌进行异源表达,利用高效液相色谱检测异源表达菌株的发酵产物。【结果】菌株SCSIO 40020被鉴定为链霉菌属菌株,从其发酵产物中分离鉴定了2个单体化合物bafilomycins A1和D。克隆了链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的生物合成基因簇并推导了其生物合成途径,在3种链霉菌中表达产生了bafilomycins。【结论】从珠江口环境中获得了一株产生bafilomycins的链霉菌SCSIO 40020,成功建立了该菌株次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达体系,并首次在链霉菌Streptomyces lividans SBT18、Streptomyces coelicolor M1154和Streptomyces albus J1074中进行了表达,获得了bafilomycins,为后续bafilomycins结构类似物的生产和链霉菌SCSIO 40020中新结构活性化合物的挖掘奠定了基础。

海洋来源节菱孢菌ZSDS1-F3中PKS-NRPS类天然产物挖掘

【目的】以基因组信息为指导,定向激活海洋来源真菌Arthrinium arundinis ZSDS1-F3中沉默的聚酮合成酶-非核糖体肽合成酶(PKS-NRPS)类生物合成基因簇,鉴定次级代谢产物结构。【方法】通过启动子工程和异源表达的策略激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,实现目标化合物的分离,通过HR-ESI-MS和NMR数据分析鉴定产物结构,结合基因重组和生物信息学分析结果推导化合物的生物合成途径。【结果】依据基因组生物信息学分析,从海洋来源真菌A.arundinis ZSDS1-F3中选取一个编码PKS-NRPS类次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,在宿主Aspergillus nidulans A1145中实现了基因簇的异源表达,从中分离到2个新化合物,并推导了其生物合成途径。【结论】基因组信息指导下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,加快真菌中新颖天然产物的发现步伐。

斑鸠霉素氧化酶CftA体外生物活性研究

【背景】斑鸠霉素及其氧化衍生物属于多环特特拉姆酸大环内酰胺类化合物,具有良好的生物活性,挖掘更多新颖斑鸠霉素类似物具有重要意义。细胞色素P450氧化酶CftA被认为能催化斑鸠霉素的氧化反应,但未有相关体外实验数据的报道。【目的】通过体外生化实验鉴定氧化酶CftA的功能,并探索其催化斑鸠霉素氧化反应的机制。【方法】利用基因合成的方法直接克隆斑鸠霉素氧化酶基因cftA,于大肠杆菌中诱导表达后,纯化蛋白进行体外酶反应,利用高效液相色谱与高分辨质谱联用技术鉴定酶反应产物。【结果】在体外,氧化酶CftA催化斑鸠霉素生成一个新的氧化衍生物Hydroxyikarugamycin D和一个已知氧化衍生物Clifednamide A。【结论】进行了细胞色素P450氧化酶CftA的体外生化研究,证实其能特异性催化斑鸠霉素C29位的两步氧化反应,为进一步探索斑鸠霉素P450氧化酶的催化机制,以及通过生物酶催化拓展斑鸠霉素类多环特特拉姆酸大环内酰胺化合物的结构多样性奠定了基础。