不同时间骨髓间充质干细胞移植对大鼠矽肺纤维化形成的影响

目的:研究外源性骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在不同时间窗的移植对大鼠矽肺纤维化的疗效。方法:体外分离、培养雄性3周龄SD大鼠BMSCs传至3代备用。将50只SD雌性大鼠随机分为5组:对照组,矽肺模型组,早期治疗组,中期治疗组,晚期治疗组(n=10)。采用非暴露式气管插管一次性灌注二氧化硅(SiO2)粉尘混悬液法建立大鼠矽肺模型(50μg/ml),并分别于造模后1、14、28 d BMSCs干预治疗(1×106ml-1),各组大鼠分别于治疗后14 d处死取材。流式细胞仪鉴定BMSCs;HE染色观察肺组织形态学变化;免疫组织化学法及Western blot法检测MMP-9,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的定位和定量表达。结果:矽肺模型组较对照组大鼠有明显炎症细胞浸润、矽结节形成、胶原沉积等病理改变。BMSCs在矽肺早期(1 d)和中期(14 d)移植治疗较矽肺模型组病理改变有明显缓解(P<0.05);BMSCs在矽肺晚期(28 d)移植治疗无显著效果(P>0.05)。结论:BMSCs的移植在矽肺纤维化早中期对大鼠的病理进程起到延缓作用,晚期治疗效果不明显。

微管相关蛋白1轻链3及Beclin-1在硅沉着病大鼠肺泡巨噬细胞中的表达

目的观察自噬相关蛋白——微管相关蛋白1轻链3(LC-3)、Beclin-1在硅沉着病大鼠肺泡巨噬细胞中的表达,从细胞自噬角度探讨硅沉着病形成的分子机制。方法 50只成年雄性SD大鼠随机分为2组(n=25):对照组和硅沉着病模型组,每组再分5个时相组。采用非暴露气管灌注二氧化硅(SiO2)粉尘混悬液法(50g/L)建立大鼠硅沉着病模型。分别于造模后1、3、7、14及28 d分批处死5只大鼠,进行原位支气管肺泡灌洗,获取肺泡巨噬细胞,进行培养纯化和富集后用于后续研究。HE染色及透射电子显微镜观察肺泡巨噬细胞形态学改变;免疫细胞化学法检测LC-3、Beclin-1的表达及分布;免疫印迹法检测LC-3、Beclin-1的蛋白表达量。结果与对照组相比模型组肺泡巨噬细胞体积较大,胞质丰富,部分细胞内可见硅沉着吞噬颗粒,电镜下可见自噬体形成;模型组LC-3、Beclin-1在各时间点的表达较对照组均增多(P<0.05),1 d即开始增多,随着时间的延长表达逐渐增多,至14 d时达高峰(P<0.05),28d时回落,但仍高于对照组的表达。结论在硅沉着病大鼠肺泡巨噬细胞中有自噬的激活,肺泡巨噬细胞自噬参与了大鼠硅沉着病的病理进程。

二氧化硅致肺泡巨噬细胞自噬对其自身分泌肿瘤坏死因子-α和转化生长因子-β的影响

目的：研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对二氧化硅（SiO2）诱导的肺泡巨噬细胞自噬的激活,是否对自身分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和转化生长因子-β（TGF-β）产生影响.方法：收集SD雄性大鼠肺泡巨噬细胞灌洗液,将其随机分为对照组,SiO2刺激组（SiO2组）,自噬抑制剂组（3-MA组）.采用体外暴露肺泡巨噬细胞染尘法,染尘成功后12 h给予10 mmol/L 3-MA干预.分别于干预后6、18、24h和36 h用胰酶消化并收集体外培养的肺泡巨噬细胞.采用H-E染色观察肺泡巨噬细胞形态学改变;免疫细胞化学检测肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的定位表达;免疫印迹检测肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的蛋白定量.结果：SiO2组与对照组相比肺泡巨噬细胞体积增大,胞质丰富,部分细胞胞质内可见矽尘吞噬颗粒.3-MA组较SiO2组肺泡巨噬细胞形态改变减轻.与对照组相比,SiO2组各时间相肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的蛋白表达显著升高,于SiO2刺激后6h开始升高,18h达高峰,24 h与36 h回落,但仍高于对照组水平.3-MA组可以显著下调SiO2组对应时间点肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的表达.结论：自噬抑制剂3-MA抑制肺泡巨噬细胞自噬后可以下调肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的表达及释放,进而促进炎症损伤的修复。

骨髓间充质干细胞抑制转化生长因子-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞间质化

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)是否通过抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞的转化,进而发挥其抗纤维化的作用及其机制。方法培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN细胞,用5μg/L的TGF-β1诱导分化,并分为对照组、转化生长因子(TGF)-β1刺激组、BMSCs干预组。采用倒置相差显微镜观察RLE-6TN细胞的形态变化;免疫荧光法检测E-钙黏蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的定位;Western blotting法检测E-cad、α-SMA、p-Smad3、Snail1蛋白的表达。结果在TGF-β1的诱导下,肺泡Ⅱ型上皮细胞逐渐向肌成纤维细胞发生形态改变,由上皮细胞的鹅卵石状变成间充质细胞的梭形或纺锤形,且伴随着上皮标志物E-cad表达降低,而间充质细胞标志物α-SMA表达上调;给予BMSCs干预后,间充质化有所抑制,表现于细胞形态趋于上皮型,且上皮标志物E-cad表达上调,间质标志物α-SMA表达减少。与对照组相比,TGF-β1刺激组p-Smad3、Snail1蛋白表达上调。给予BMSCs干预后p-Smad3、Snail1蛋白表达显著降低。结论 BMSCs可能通过阻断TGF-β1/Smad3信号转导通路,抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞的转化,从而抑制上皮细胞-间充质转化的进程。

转染过表达miR-101的BMSCs对大鼠矽肺纤维化的抑制作用

目的探究转染过表达miR-101的骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠矽肺纤维化的抑制作用。方法选取40只健康雄性大鼠随机分为4组,每组均10只,分别为对照组、SiO_(2)模型组、BMSCs治疗组、miR-101 BMSCs治疗组。另选取15只3周龄SD雌性大鼠,分离培养BMSCs,传至第3代用于后续实验。采用慢病毒载体(LV-rno-mir-101a)构建稳转的过表达miR-101BMSCs,培养至转染最佳效率备用。SiO_(2)模型组、BMSCs治疗组、miR-101 BMSCs治疗组采用非暴露式气管插管一次性注入灭菌NaCl与SiO_(2)粉尘混悬液构建矽肺大鼠模型。造模后24 h内,BMSCs治疗组、miR-101 BMSCs治疗组分别尾静脉注射BMSCs与DMEM悬液1.0 ml(2×10^(6)/L)、miR-101 BMSCs与DMEM悬液1.0 ml(2×10^(6)/L)干预抑制,所有大鼠于治疗第14天取材。HE染色观察大鼠肺组织形态学改变,免疫印迹法检测TNF-α、IL-6、Beclin-1、LC3、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白定量表达水平。结果LV-rno-mir-101a成功构建并稳转miR-101 BMSCs,于转染72 h后,采用荧光显微镜细胞计数,其转染效率达90%以上,满足本实验需要。SiO_(2)模型组较对照组大鼠自噬激活、炎细胞浸润、胶原沉积等病理改变显著增强(P<0.05),BMSCs治疗组和miR-101 BMSCs治疗组较SiO_(2)模型组大鼠自噬和炎细胞浸润均减弱(P<0.05),miR-101BMSCs治疗组较BMSCs治疗组自噬、炎细胞浸润和胶原沉积等状态改善更为显著(P<0.05)。结论外源性转染过表达miR-101 BMSCs比单纯BMSCs移植对抑制矽肺大鼠纤维化效果更为突出,能明显抑制自噬激活,改善肺组织炎症反应及纤维化程度,为矽肺的基因治疗提供了实验室依据,有待临床实验进一步验证。

尼莫地平对脑创伤后的神经保护作用

目的探讨尼莫地平对脑创伤后的神经保护作用机制。方法取各项指标均匀的SD大鼠80只,运用随机抓取法分为实验组和对照组,液压打击法模拟脑创伤症状。每组再分为12 h、1 d、2 d、4 d四个时间点,每个时间点各10只SD大鼠。实验组每3 h给予尼莫地平1 mg/kg,对照组只给予同剂量的生理盐水。在各时间点取SD大鼠静脉血,采取免疫放射法测血清IL-1、TNF-α浓度。用激光多普勒血流仪检测实验开始前、对照组和实验组SD大鼠两侧大脑皮层血流的变化。结果各时间点实验组IL-1、TNF-α浓度比对照组明显降低(P均<0.05),脑创伤后大脑皮层血流明显降低(P<0.01),使用尼莫地平后各时间点实验组大脑皮层血流较对照组明显增加(P均<0.05)。结论尼莫地平可以降低脑创伤后IL-1、TNF-α浓度,增加大脑皮层血流,对脑创伤后神经起保护作用。

复合营养素对高温运动小鼠行为和疲劳的影响

目的探讨高温对运动小鼠学习记忆能力、行为活动能力和疲劳的影响及复合营养素的干预效果。方法将无特定病原体级健康雄性昆明小鼠随机分为常温运动组、高温运动组和高温运动补充组,每组10只。3组小鼠每天进行1 h跑台运动,每周运动6 d,持续4周。于每次跑台运动前30 min对高温运动补充组小鼠灌胃予复合营养素0.3 mL,常温运动组和高温运动组灌胃予等体积蒸馏水。跑台运动结束后进行神经行为学实验。采集各组小鼠血清,检测乳酸、尿素氮水平和肌酸激酶活力,取肝脏和腓肠肌组织进行肝糖原和肌糖原水平检测。结果与常温运动组小鼠比较,高温运动组小鼠逃避潜伏期延长(P<0.05),穿台次数、目标象限时间百分比和路程百分比均降低(P值均<0.05);与高温运动组小鼠比较,高温运动补充组小鼠逃避潜伏缩短(P<0.05),穿台次数、目标象限时间百分比和路程百分比均增加(P<0.05)。与常温运动组小鼠比较,高温运动组小鼠首次跌落时间和抓力均降低(P值均<0.05),跌落次数增加(P<0.05);与高温运动组小鼠比较,高温运动补充组小鼠首次跌落时间和抓力均增加(P值均<0.05),跌落次数减少(P<0.05)。与常温运动组小鼠比较,高温运动组小鼠血清中乳酸、尿素氮水平和肌酸激酶活力均增加(P值均<0.05),肝糖原和肌糖原水平均降低(P值均<0.05);与高温运动组小鼠比较,高温运动补充组小鼠血清中乳酸、尿素氮水平和肌酸激酶活力均降低(P<0.05),肝糖原和肌糖原水平均增高(P<0.05)。结论高温可导致运动小鼠学习记忆能力和行为活动能力下降,产生运动性疲劳;补充复合营养素可预防出现上述变化。