铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb)-OprF疫苗。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株提取总RNA为模板,自行设计引物,RT-PCR扩增获得OprF抗原编码基因,经酶切、连接定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF。转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒行酶切电泳和测序验证后,电穿孔转化到Bb中,构建铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果 RT-PCR扩增出1 016bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切鉴定,切出4 947bp的载体片段和10 16bp的目的基因片段;以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1 016bp的oprF基因片段。结论成功构建了铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定基础。

铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的研究

目的研究铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb)-OprF疫苗免疫小鼠,PAO1株攻击后产生的细胞免疫应答。方法将rBb-OprF疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔黏膜和口服灌胃4种途径免疫Balb/c小鼠,免疫后8周用5×106CFU的PAO1株攻击,攻击1周后杀鼠取脾,MTT法检测特异性脾淋巴细胞增殖,流式细胞术检测脾CD4+T和CD8+T细胞比率,用ELISA法检测脾细胞培养上清IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10的水平。结果脾T淋巴细胞增殖明显;脾细胞CD4+和CD8+T细胞亚群显著增加;脾细胞培养上清IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10的水平显著升高,其中IFN-γ最为显著。结论铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗可诱导小鼠产生混合型的Th1和Th2免疫应答。

肺癌患者发生肺栓塞的相关危险因素及对预后的影响

目的探讨肺癌患者发生肺栓塞(PTE)的危险因素,并分析其对患者预后的影响。方法 46例肺癌合并PTE患者为观察组,46例无PTE的单纯肺癌患者为对照组。对比2组患者性别、年龄、体质量指数(BMI)、病理类型、TNM分期、手术史、中心静脉置管、血红蛋白(Hb)、D-二聚体、吸烟史、饮酒史、放化疗史、COPD史、糖尿病病史、心脑血管疾病史,并进行Logistic回归分析,探讨肺癌发生PTE的危险因素,并对比2组患者3、6、12个月生存率与中位生存时间。结果 2组患者在性别、年龄、手术史、吸烟史、饮酒史、放疗史、糖尿病病史、心脑血管病史方面比较无显著差异(P>0.05),而在BMI、病理类型、TNM分期、Hb、D-Dimer、化疗史、中心静脉置管、COPD病史方面具有显著差异(P<0.05或P<0.01)。Logistic回归分析发现,病理类型为腺癌、TNM分期高、D-Dimer浓度高、有化疗史均为肺癌患者发生PTE的独立危险因素(P<0.05或P<0.01)。观察组3、6、12个月生存率均显著低于对照组(P<0.05或P<0.01),观察组中位生存时间显著短于对照组(P<0.01)。结论PTE将严重缩短肺癌患者生存期,降低生存率。对病理类型为腺癌、TNM分期较高、D-Dimer浓度较高、有化疗史的肺癌患者,应早期给予抗凝治疗,以降低PTE风险,延长患者生存期,提高患者生活质量。

囊性棘球蚴病免疫发病机制研究进展

本文从宿主对棘球蚴感染的先天性抵抗、早期免疫、包囊形成期免疫、影响CD4+T细胞分化因素、细胞因子在细粒棘球绦虫(Eg)感染中的作用、Eg感染与变态反应、Eg感染的逃避机制等7个方面进行了综述。

细粒棘球绦虫Eg95抗原编码基因在BCG中的表达效率研究

目的探讨细粒棘球绦虫Eg95抗原在BCG中的表达,为囊型包虫病疫苗的开发利用提供依据。方法用热诱导方法诱导rBCG-Eg95疫苗,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定所表达的蛋白。结果表达重组蛋白为可溶性蛋白,分子质量单位为16.5ku。Westernblot示重组蛋白具有抗原性,用薄层扫描Bio-RadQuantityone分析系统分析,表达效率为占BCG菌体总蛋白的12%。结论细粒棘球绦虫Eg95抗原在BCG中成功表达,为BCG发展为多价疫苗载体奠定了基础。

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗构建及鉴定

目的构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗并鉴定。方法从包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因并鉴定。将该基因片段定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG中构建pBCG-Eg95重组质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG-Eg95疫苗,用HgCl2筛选经PCR鉴定。结果经电泳及测序证实从原头节扩增出471bp Eg95蛋白编码基因。重组质粒pBCG-Eg95经酶切及PCR证实,并经PCR鉴定已成功转入BCG。结论成功构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,为rBCG-Eg95疫苗进一步研究奠定基础。

不同医疗机构医院获得性肺炎转归及病原构成的回顾性分析

目的了解重庆地区医院获得性肺炎(hospital acquired pneumonia,HAP)治疗转归、病原学分布及其耐药性特点,为本地区治疗HAP提供资料和依据。方法选取重庆市不同等级4家医疗机构在2009年1月至2010年12月符合HAP诊断标准的病例512例,对患者的性别、年龄、治疗转归、基础疾病、病原学及其耐药谱进行回顾性对照研究。结果 4家医疗机构的HAP患者性别不存在差异,平均年龄以重庆市第一福利院(78.6岁)最高,与其他3组存在显著性差异(P<0.05)。HAP总死亡率为23.4%。与本次住院直接相关的基础疾病分析显示脑卒中及其后遗症是导致HAP最常见的原因(24.4%),其次是呼吸衰竭(包括急性和慢性)(17.2%),其他依次为心血管病(8.3%)、肿瘤(7.7%)、手术后(7.1%)、慢性阻塞性肺疾病(6.9%)、尘肺(5.9%)、糖尿病(4.4%)、老年痴呆(3.8%)、营养不良(2.4%)。HAP病原菌以G-菌为主,占73.2%,以铜绿假单胞菌(27.2%)最常见;G+菌占22.9%,以金黄色葡萄球菌(13.0%)最常见;真菌占3.9%,均为混合感染。在福利院发生的HAP病原菌以肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和表皮葡萄球菌为主。结论重庆地区HAP死亡率较高,脑卒中及其后遗症是导致HAP最常见的原因。在福利院与在其他医疗单位发生的HAP病原谱不同。HAP病原菌以铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌为主,耐药情况严重。

农村三级卫生服务体系存在的问题和对策研究

农村三级卫生服务体系是我国农村卫生服务的基础,但还存在硬件设施建设不足,卫生服务人员素质不高,疾病谱的变化等问题。如何推动农村卫生服务建设,利用三级卫生服务网络,提高农村卫生服务能力是建设的关键和目的。

肿瘤浸润淋巴细胞培养中掺杂肿瘤细胞的清除

根据肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）培养过程中掺杂肿瘤细胞具有粘附、贴壁的特性，将掺杂的肿瘤细胞通过移孔法清除，使ＴＩＬ对数生长期至少可提前４ｄ。由于大量掺杂肿瘤细胞在移孔中被清除，解除了肿瘤细胞对ＴＩＬ的抑制，使增殖倍数有所增加，最高可以达到１０倍。比项研究为临床肿瘤病人用ＴＩＬ治疗打下良好基础，为ＴＩＬ在手术后及早应用及其安全性提供了实验依据。

细胞凋亡荧光染色法检测肿瘤化疗药物敏感性并与MTT法的比较

本文根据化疗药物诱导肿瘤细胞产生凋亡的机制,采用细胞凋亡荧光染色法(AFS)分别检测了卵巢癌细胞株(3AO)、部分肺癌患者分离的癌细胞药物敏感性,并和传统的ATT法进行比较.用不同浓度的顺铂诱导3AO凋亡、两种方法学之间没有显著性差别(P>0.05);但用于肺癌患者分离的肿瘤细胞进行药物的筛选时,有显著性差别(P<O.05);AFS避免了MTT多种影响因素,比MTT快速、准确、敏感、重复性好,同时能观察凋亡、坏死及活细胞,有可能成为一种新的用于肿瘤化疗药物的筛选方法.

一种高活力分离肿瘤浸润淋巴细胞方法的建立

肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）的增殖力、活力、杀伤力是ＴＩＬ临床治疗的基本问题。由于Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ方法存在着许多不足之处。本实验室对其一些重要步骤进行了改进：①用单一冷胶原酶消化肿瘤组织块；②省去影响ＴＩＬ活力的离心操作；③ＴＩＬ培养４８ｈ内除去掺杂在ＴＩＬ中的肿瘤细胞等。由于除去了影响ＴＩＬ活力的抑制因素，ＴＩＬ的增殖率、生存率、活力、杀伤力明显增加。有８０％肿瘤组织的ＴＩＬ经扩增可超过１×１０￣９细胞数，生长周期曲线反映了冷酶法的增殖率超过Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ方法。本方法的建立，为ＴＩＬ克隆、建株打下了基础，显示了ＴＩＬ临床治疗潜能的提高。

多房棘球绦虫pBCG-Em14-3-3重组质粒的构建及其在BCG中的表达

目的构建多房棘球绦虫重组质粒pBCG-Em14-3-3,并转化BCG进行表达。方法超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Em14-3-3抗原编码基因;将该扩增产物定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG,构建重组质粒pBCG-Em14-3-3;电穿孔法转化BCG,构建多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3。免疫印迹分析pBCG-Em14-3-3的表达产物。结果RT-PCR成功扩增出779bp的Em14-3-3抗原编码基因;双酶切证实Em14-3-3抗原编码基因成功插入pBCG中;PCR证实rBCG-Em14-3-3构建成功;免疫印迹分析发现pBCG-Em14-3-3的表达产物在相对分子质量(Mr)约为27×103处有明显的目的蛋白表达条带,且能被活动性泡球蚴病鼠血清特异识别。结论成功构建了多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3。

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定多房棘球绦虫(Em)重组双歧杆菌(Bb)-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗。方法通过PCR扩增EmⅡ/3和Em14-3-3抗原编码基因,然后采用基因拼接法(geneSOEing)剪接EmⅡ/3和Em14-3-3,得到EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3;用电穿孔法将该质粒导入Bb,构建多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗。结果PCR成功扩增出2554bp的EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;双酶切证实EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗构建成功。结论成功构建了多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗,为该疫苗的开发和利用打下了坚实的实验基础。

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗构建及其表达效率

目的 构建多房棘球绦虫（Em）重组卡介苗（BCG—EmⅡ／3）疫苗，分析EmⅡ／3分子在该疫苗中的表达效率。方法 超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA，通过RT-PCR扩增EmⅡ／3的抗原编码基因；将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG，构建重组质粒pBCG—EmⅡ／3；电穿孔法转化BCG，构建多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ／3疫苗。免疫印迹分析重组BCG-EmⅡ／3疫苗的表达产物。结果 RT-PCR成功扩增出1680bp的EmⅡ／3抗原编码基因；双酶切证实EmⅡ／3抗原编码基因成功插入pBCG中；PCR证实rBCG—EmⅡ／3疫苗构建成功；免疫印迹分析发现重组BCG—EmⅡ／3疫苗的表达产物在相对分子质量（Mr）约为65×10^3处有明显的目的蛋白表达条带，且能被活动性泡球蚴病鼠血清特异识别。结论 成功构建了多房棘球绦虫重组BCG—EmⅡ／3疫苗，为疫苗的开发和利用打下了坚实的理论基础。

卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞某些细胞因子基因表达的研究

目的:研究卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞在体外扩增后某些细胞因子的表达.方法:利用RT-PCR和免疫学方法,分离5例刚分离的上皮性卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和其中3例腹水标本中肿瘤相关淋巴细胞(TAL),检测其在体外扩增后,IL-2,IL-2R,TNF-α,IFN-γ,IL-6等细胞因子基因的表达的水平与变化;测定细胞培养上清液中细胞因子的活性,分析TIL或TAL扩增前后杀伤肿瘤细胞的能力和免疫学特性的变化.结果:TIL在扩增前后的4周时间内,仅TNF-α mRNA基因表达是持续的,并可维持相当长一段时间;IFN-γmRNA基因的表达缺乏;IL-2mRNA基因表达只是一过性.体外加入抗CD3单抗或PHA(合适浓度)刺激TIL或TAL,IL-2,TNF-α,IhN-γmRNA表达明显增强.和TIL细胞因子基因表达不尽相同的是,TAL表达IL-6 mR-NA.结果还发现,体外IL-2的浓度对TIL的免疫学特性有很大的影响.结论:TIL在体外经rIL-2扩增后,免疫活性有明显提高.TIL的抗肿瘤活性在很大程度上依靠其分泌的多种细胞因子.

超抗原SEB和D-氨基半乳糖对小鼠肝细胞的作用观察

用超抗原葡萄球菌Ｂ型肠毒素（ＳＥＢ）、Ｄ－氨基半乳糖（Ｄ－ＧａｌＮ）及两者合用腹腔注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，于２、６、１２、２４ｈ取肝脏和血标本，从形态学和生化指标来研究肝细胞的死亡模式；同时还检测了小鼠２４ｈ死亡率。结果发现单用ＳＥＢ可诱导肝细胞凋亡，其机制可能与ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ等细胞因子的产生和作用有关。单用Ｄ－ＧａｌＮ可同时引起肝细胞凋亡和变性，ＳＥＢ和Ｄ－ＧａｌＮ合用２、６ｈ见肝细胞凋亡，１２ｈ后以肝细胞坏死为主，小鼠２４ｈ死亡率达５０％。因而，推测凋亡与坏死间存在一定的联系。

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠脾细胞淋巴因子变化的研究

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组BCG-Eg95疫苗免疫后对受攻击小鼠的包囊减重率及脾细胞淋巴因子的影响。方法细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗分别采用皮下注射、鼻腔内接种、口服灌胃和肌肉注射4种途径免疫BALB／C小鼠,免疫后8周用Eg原头节攻击感染,50个Eg原头节／每只小鼠,感染后18周剖杀小鼠,分离并称重细粒棘球蚴,计算包囊减重率;取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原(EgAg)或伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激培养,收集脾细胞培养上清液,检测脾细胞培养上清液的白介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-4(IL-4)水平。同时设卡介苗(BCG)和磷酸盐缓冲液(PBS)对照。结果以上4种疫苗接种组的包囊减重率分别为45．77％、1820％、88．05％和9246％;疫苗肌肉接种组的IL-2、IFN-γ和TNF-α均较PBS对照为高,分别为(30．0±0)pg/ml、(65．0±0)pg/ml和(425．0±10．7) pg/ml,IL-4低于PBS对照组,为(10．0±0)pg／ml。结论细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠产生辅助性T细胞1型(Th1)反应,从而对抗Eg原头节攻击感染。