重组结核分枝杆菌Ag85b蛋白原液纯度反向高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的 建立检测重组结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85b蛋白原液纯度的反向高效液相色谱法,并进行验证。方法 设计4因素3水平正交试验,将面积、拖尾因子、峰面积、峰面积RSD作为评价指标进行分析,摸索最适检测条件,并依据《中国药典》四部(2020版)9101药品质量标准分析方法验证指导原则进行专属性、线性范围、精密度、耐用性等验证。结果 当检测条件为有机相洗脱比例30%~95%、检测温度35℃、进样量3μg、95%有机相洗脱时间15 min时,各评价指标结果均较好,在该检测条件下线性相关系数(R2)为0.998 5,线性范围为1.8~4.2μg;重复性RSD为0.01%;中间精密度RSD为0.16%;在柱温与流速细微变动下均具有良好的耐用性。结论 建立了重组MTBAg85b蛋白原液纯度检测的反向高效液相色谱法,该方法专属性强,精密度、耐用性好,可用于重组MTBAg85b蛋白原液质量控制。

卡介苗活性快速检测方法的建立及验证

目的建立卡介苗(Bacille Calmette-Guérin vaccine,BCG)活性的快速测定方法,并进行初步验证。方法将ATP标准品稀释为6.25×10^(-10)~2×10^(-8)mol/L,采用生物荧光法进行检测,获得相对荧光强度(relative light unit,RLU),建立ATP浓度与RLU的标准曲线。分别通过离心法、本底法和ATP酶法提取9批低剂量(0.25、0.375、0.5 mg/mL)和6批高剂量(60 mg/mL)BCG的ATP,采用生物荧光法检测ATP含量,并评价其与活菌数(活菌计数法检测)的相关性。验证该方法的重复性和中间精密性。结果ATP浓度在6.25×10^(-10)~2×10^(-8)mol/L范围内,与RLU呈良好线性关系,回归方程为y=1680.4 x-574.46,R^(2)=0.9987。离心法提取高剂量及低剂量BCG的ATP的含量与相应活菌数无显著相关性(P>0.05);本底法和ATP酶法提取高剂量BCG的ATP的含量与相应活菌数具有显著相关性(P<0.05),两种方法提取低剂量BCG的ATP的含量与相应活菌数无显著相关性(P>0.05)。重复性和中间精密性验证的RSD均<8%。结论建立的高浓度BCG活性的快速检测方法具有良好的重复性和中间精密性。