外源性阻断RAGE效应对糖尿病小鼠创面中巨噬细胞浸润的影响

目的·通过外源性阻断糖基化终末产物受体(RAGE)后,观察RAGE效应对糖尿病小鼠创面愈合过程中巨噬细胞浸润的影响。方法·96只雄性8周龄C57BL/6J小鼠随机分成糖尿病组(n=72)和正常对照组(n=24)。多次小剂量链脲佐菌素腹腔注射诱导糖尿病小鼠模型,并用灭菌9 mm直径环钻于小鼠背部制造全层皮肤缺损创面模型。伤后正常对照组创面局部用0.9%氯化钠溶液(N组);糖尿病组再随机分成3组,糖尿病空白对照组(C组)创面局部外用0.9%氯化钠溶液,糖尿病Ig G对照组(I组)创面局部外用兔Ig G,糖尿病RAGE干预组(R组)创面局部外用RAGE抗体。再于伤后第3日和第7日,给予相同处理。通过大体评估创面愈合情况;于伤后第1、3、7日切取创缘皮肤样本,免疫组织化学染色标记并计数创面中巨噬细胞数量,透射电子显微镜下观察巨噬细胞超微结构。结果·(1)伤后第14日,R组创面愈合面积百分比显著高于C组和I组(均P=0.000)。(2)伤后第1日,N组和R组CD68+巨噬细胞数均显著多于C组(均P=0.000);伤后第14日,N组和R组巨噬细胞数均显著少于C组(均P=0.000)。(3)电子显微镜下对比创面组织的巨噬细胞形态及结构,存在明显不同。结论·糖尿病创面环境中,RAGE效应与创面巨噬细胞浸润数量及形态的异常密切相关,从而参与了糖尿病创面的难愈。

ATP代谢及嘌呤信号受体在糖尿病创面愈合炎症反应阶段的变化

目的·探讨胞外腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)代谢及其相关指标在糖尿病创面损伤修复炎症反应阶段的变化。方法·将96只C57BL/6J小鼠随机分成4组,每组24只,包括正常空白对照组(NC组)、正常ATP干预组(NA组)、糖尿病空白对照组(DC组)和糖尿病ATP干预组(DA组),其中采用多次小剂量链脲佐菌素腹腔注射诱导DC组和DA组小鼠建立糖尿病模型。所有小鼠于背部制造全层皮肤缺损创面模型,而后NC组和DC组小鼠的创面局部外用双蒸水处理,NA组和DA组小鼠的创面局部外用ATP溶液处理。通过苏木精-伊红染色观察创面中性粒细胞浸润。采用酶联免疫吸附测定检测髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)含量,超高效液相色谱-串联质谱法检测ATP及其代谢产物含量。利用免疫组织化学染色法观察Connexin43、Pannexin1、CD39、P2X7及P2Y2的阳性表达。通过计算创面愈合速率评估创面愈合速度。结果·①创面愈合炎症反应阶段,DC组小鼠创缘组织MPO含量,中性粒细胞浸润数量,ATP含量,Connexin43、Pannexin1、CD39、P2X7及P2Y2的表达量均低于NC组(均P<0.05)。②伤后第14日,DA组小鼠创面愈合率明显高于DC组(P=0.000)。结论·在糖尿病创面愈合炎症反应阶段,炎症反应存在一定的不足,ATP、ATP水解酶及嘌呤信号受体均呈低水平状态,外源性补充ATP可在一定程度上加快糖尿病创面愈合速度。

miR-485-5p靶向调节婆罗双树样基因4/莫洛尼白血病毒插入点1对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移及凋亡影响

目的miR-485-5p靶向调节婆罗双树样基因4(SALL4)/莫洛尼白血病毒插入点1(BMI-1)对瘢痕疙瘩成纤维(KFBs)细胞增殖、迁移及凋亡的影响。方法选取自2021年5月至2022年5月惠州市中心人民医院收治的21例瘢痕疙瘩患者为研究对象。无菌条件下切取人瘢痕疙瘩组织,分离培养成KFBs细胞。将KFBs细胞分为miR-NC组(空白载体)、KFBs细胞组、miR-485-5p inhibitor组(miR-485-5p低表达)、miR-485-5p mimics组(miR-485-5p过表达)。4组KFBs细胞均以37℃、5%CO_(2)湿润环境中培养72 h。应用噻唑蓝比色法测定细胞增殖水平;采用流式细胞仪测定细胞凋亡水平;Transwell法评估细胞侵袭能力;实时聚合酶链反应及蛋白印迹法测定细胞miR-485-5p、SALL4、BMI-1 mRNA及蛋白水平。结果与KFBs细胞组比较,miR-485-5p inhibitor组吸光度(OD)值、存活率、穿膜数、SALL4、BMI-1 mRNA和蛋白水平升高,miR-485-5p mimics组OD值、存活率、穿膜数、SALL4、BMI-1 mRNA和蛋白水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与miR-485-5p inhibitor组比较,miR-485-5p mimics组OD值、存活率、穿膜数、SALL4、BMI-1 mRNA和蛋白水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与KFBs细胞组比较,miR-485-5p inhibitor组细胞凋亡率降低,miR-485-5p mimics组细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与miR-485-5p inhibitor组比较,miR-485-5p mimics组细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-485-5p过表达能显著抑制KFBs增殖、迁移,促进细胞凋亡,其机制可能与miR-152-5p靶向调节SALL4,同时抑制BMI-1表达,进而抑制SALL4/BMI-1通路的激活有关。

阻断糖基化终末产物受体效应对小鼠糖尿病创面炎症反应的影响

目的通过观察阻断糖基化终末产物受体(RAGE)效应后对小鼠糖尿病创面炎性细胞浸润及炎症因子分泌情况的影响,推测RAGE对创面炎症反应的可能影响和效应环节。方法 96只雄性8周龄C57BL/6J小鼠随机分成糖尿病组(n=72)和正常对照组(N组)(n=24)。糖尿病组小鼠多次小剂量链脲佐菌素腹腔注射,诱导糖尿病小鼠模型,并运用灭菌9 mm直径环钻于所有小鼠背部,制造全层皮肤缺损创面模型,伤后N组小鼠创面局部运用0.9%氯化钠溶液20μL,糖尿病组随机分成3组,糖尿病空白对照组(C组)局部外用0.9%氯化钠溶液20μL、糖尿病IgG对照组(I组)局部外用兔IgG 20μL、糖尿病RAGE干预组(R组)创面局部外用兔抗鼠RAGE多克隆抗体20μL。隔日分别给予上述对应的药物,直至伤后7 d。致伤当日及伤后1、3、7 d取材,制备标本待用,苏木精-伊红(HE)染色观察各组创面愈合的情况及愈合过程中中性粒细胞的浸润变化,免疫组织化学染色观察RAGE表达和巨噬细胞的浸润,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测创周组织炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ干扰素、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-6(IL-6)、髓过氧化物酶(MPO)含量;透射电子显微镜下观察创面巨噬细胞吞噬现象的情况。对数据行方差分析、t检验。结果 N组和C组小鼠皮肤组织中均可见RAGE阳性表达,且C组小鼠创面表达明显强于N组,RAGE主要分布于细胞表面。伤后14 d,R组创面愈合率为(89.65±1.49)%,明显高于C组(76.21±0.69)%与Ⅰ组(78.81±1.01)%,差异均有统计学意义(t=18.771、14.026,P值均小于0.05)。伤后1 d,N组TNF-α、IL-1α、IL-6水平均明显高于C组,差异均有统计学意义(t=5.871、34.005、17.698,P值均小于0.05);R组TNF-α、IL-1α、IL-6水平均明显高于C组,差异均有统计学意义(t=10.275、27.295、18.591,P值均小于0.05)。伤后3 d,N组TNF-α、IL-1α、IL-6水平均明显低于C组,差异均有统计学意义(t=24.758、26.674、27.275,P值均小于0.05);R组TNF-α、IL-1α、IL-6水平均明显低于C组,差异均有统计学意义(t=17.819、15.584、29.360,P值均小于0.05)。伤后1 d,MPO含量N组(444.71±28.27)pg/m L和R组(476.65±38.76)pg/m L均明显高于C组(173.73±28.27)pg/m L,差异均有统计学意义(t=11.759、10.937,P值均小于0.05);相反,伤后3 d,MPO含量N组(214.05±46.55)pg/m L和R组(267.07±52.49)pg/m L均明显低于C组(491.90±38.21)pg/m L,差异均有统计学意义(t=7.991、5.998,P值均小于0.05)。伤后3 d,中性粒细胞个数,相比于N组(35.67±5.03)个和R组(36.67±4.16)个,C组创面创周中性粒细胞数量(83.00±4.58)个明显增多,差异均有统计学意义(t=10.833、5.376,P值均小于0.05)。伤后1、3 d,CD68+细胞数量计数N组(76.60±9.07)、(121.40±9.96)个和R组(51.00±8.92)、(89.60±7.89)个均明显多于C组(15.00±4.93)、(50.00±8.40)个,差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。伤后3 d,N组和R组均可探测到典型巨噬细胞吞噬中性粒细胞现象存在,而C组和R组未及此现象。结论糖尿病创面环境中,中性粒细胞的消退、早期巨噬细胞的浸润及吞噬均受到了抑制,伤后炎症因子分泌表现为早期不足和消退迟滞的现象,且均呈现RAGE途径依赖性,提示糖尿病创面早期炎症反应失调,创面迁延难愈与RAGE介导效应相关。