建立CAR-T细胞治疗产品质量控制检测方法及其定量参考品的数字PCR方法研究

目的:本研究建立嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗产品质量控制中猿猴病毒40大T抗原(SV40LTA),腺病毒早期区域1A蛋白(E1A)和质粒残留水平的荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法,同时采用微流控芯片式数字PCR技术对质粒定量参考品进行赋值。方法:通过建立多重荧光定量PCR的方法,在一个反应中同时检测SV40LTA和E1A的残留水平。针对目前慢病毒等包装技术存在多种质粒组合系统(如四质粒和五质粒),对质粒的残留检测标准难以统一,本研究从同源性很高的复制子区域入手,设计和筛选引物探针,能同时检测多种不同质粒的总体残留水平。建立数字PCR技术分别对SV40LTA和E1A的质粒定量参考品拷贝数浓度标定方法进行方法学验证和赋值。结果:SV40LTA和E1A双重定量PCR方法的特异性好,最低定量限分别达到2.80×10和2.98×10 copies·μL^(-1)。质粒残留检测法的最低定量限可达到2.80×10 copies·μL^(-1)。通过采用目前快速发展的数字PCR技术进行赋值,经典吸光度法计算质粒定量参考品SV40LTA和E1A的拷贝数浓度为2.80×10^(8)和2.98×10^(8) copies·μL^(-1);经数字PCR标定分别为1.06×10^(8)和1.21×10^(8) copies·μL^(-1)。结论:本研究建立的SV40LTA,E1A和质粒检测方法灵敏度较高、特异性强,能满足CAR-T细胞治疗产品的质量控制要求。经典的吸光度法定值的结果大于数字PCR方法,大约有2倍左右的差别。