利用锁核酸化学偶联FokⅠ核酸酶靶向切割HBV基因的体外实验

乙肝病毒（HBV）是有缺口的双链DNA病毒,侵入人体肝细胞后形成共价闭合环状DNA（ccc DNA）持续复制,并在逆转录过程中随机整合入宿主基因组。慢性乙型肝炎感染者平均每个细胞中含有33个ccc DNA拷贝,半衰期长达35~57 d,很难从体内彻底清除。利用锁核酸抑制HBV转录,是乙肝治疗的新策略。此外,利用基因组编辑技术靶向切割HBV基因组,有望从源头治愈乙型肝炎。基于锁核酸与双链DNA形成三股螺旋的能力、抵御核酸酶及聚合酶的稳定性以及对单碱基错配的敏感性,本研究以靶向切割乙型肝炎病毒为例,设计构建锁核酸修饰的寡核苷酸作为DNA结合域,有效增强对靶基因的特异性识别;同时利用FokⅠ核酸酶分子量小、二聚化时才具有酶活等特点,设计构建FokⅠ切割域二聚体重组蛋白作为DNA切割域;进而通过双功能交联剂GMBS,建立了5′端氨基（-NH2）修饰的锁核酸与N端巯基（-SH）修饰的FokⅠ核酸酶定向化学偶联的方法,并在体外验证了新型工具对HBV基因的靶向切割。该方法为此后在体内进行高特异性、无整合风险的抗病毒基因治疗提供了全新的技术思路。

CUT&Tag产物回收和建库方法的优化

新兴的染色质靶向切割和标签化(clevage under target and tagment,CUT&Tag)技术利用转座酶在目标蛋白结合的DNA附近进行切割并对切割下的DNA片段进行标签化,通过后续的二代测序可以快速鉴定蛋白质-DNA相互作用,极大的简化了染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)的实验过程。CUT&Tag中转座酶完成标签化后需要DNA回收或其他后处理才能进行建库PCR,不同的回收方法对CUT&Tag结果有着显著的影响。通过建立生物素化转座体-链霉亲和素磁珠体系(streptavidin beads recovery CUT&Tag,srCUT&Tag),可以快速便捷地完成CUT&Tag的产物回收。本文在K562细胞中展开H3K4me3、RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ)、转录因子CTCF和HMGA1的CUT&Tag实验,并利用现有的乙醇沉淀、片段分选(solid-phase reversible immobilization,SPRI)磁珠回收和直接PCR法,以及本研究建立的srCUT&Tag方法对产物进行回收。结果表明,从整体上看,SPRI磁珠回收和srCUT&Tag方法着较高的回收效率,而乙醇沉淀法则回收效率低下。在全部4种CUT&Tag产物回收过程中,SPRI磁珠回收均会损失大部分小于150 bp的产物片段。在CTCF和HMGA1 CUT&Tag产物的回收中,直接PCR法则损失了大部分大于300 bp的片段并与其他回收方法的结果有较大的差别。因此,srCUT&Tag能够比其他三种回收方法提供更多更完整的测序信息。综上所述,新建立srCUT&Tag回收方法相比现有的CUT&Tag产物回收方法能提高建库效率并得到更好的数据质量,为表观遗传学研究提供了更好的技术选择。

重组右旋糖酐酶的表达、纯化及性质研究

将Lipomycesstarkeyi CGMCC 2.1390菌株的DEX基因进行PCR扩增并克隆至表达载体pPICZαA上,将重组质粒转化至Pichia pastoris X33细胞中进行甲醇诱导分泌表达。质粒转化至Pichia pastoris X33细胞中,经1%甲醇诱导72h表达重组蛋白,培养基上清中DEX浓度和酶活力分别为14.3mg/L、25648U/L。重组蛋白经过两步层析纯化后,纯度为90%,酶活力回收率为58.4%,比活力为7130U/mg。重组DEX最适反应温度为35℃,最适反应p H值为5.0,酶在低于40℃、p H3.0～8.0稳定。以右旋糖酐20k Da为底物,酶的Km值为6.2×10^(-4)mol/L,Vmax值为4.0×10^(-3)mol/min·L;以右旋糖酐70kDa为底物,酶的K_m=7.4×10^(-5)mol/L,V_(max)=3.0×10^(-3)mol/min·L。Zn^(2+)对酶活力有微弱促进作用,Ca^(2+)对酶活力有轻微抑制。10%Sucrose有利于提高重组DEX的保存稳定性。

张江高新区园区单位荣获多项国家科技大奖

2014年1月10日上午，中共中央、国务院在京隆重举行国家科学技术奖励大会，共授奖10位科技专家和313项成果。党和国家领导人习近平、李克强、刘云山、张高丽出席大会并为获奖代表颁奖。

抗VEGF单克隆抗体Fab片段在E.coli中的分泌表达

目的:在大肠杆菌中构建、表达和纯化抗血管内皮生长因子(VEGF)的Fab片段(兰尼单抗,ranibizumab),通过发酵条件的控制实现其在大肠杆菌周质和胞外的高效分泌表达,并检测其抗VEGF的活性。方法:以pET30a为质粒载体,构建了Fd链和L链前都含有OmpA信号肽、SD序列和T7 promoter的克隆载体pET30a(+)-LC-HC,转化BL21(DE3)表达菌株,并进行了培养基、温度和IPTG诱导浓度的条件优化。结果:确定Fab片段在大肠杆菌分泌表达摇瓶发酵最佳条件为:在含有1.5%Tryptone,1%Yeast Extract,0.5%Glucose,0.15%NaCl,0.1%NH4Cl,0.08%MgCl2·6H2O的1L培养基的摇瓶中,按照10%的接种量,37℃摇床培养至对数生长后期(OD600为2左右),添加0.1mmol/L IPTG诱导剂,于16℃条件下诱导表达过夜(16h左右)。用周质破菌提取分泌至大肠杆菌周质腔的Fab片段,同时用中空纤维柱浓缩发酵培养基,最后用ProteinG亲和层析柱一步纯化洗脱,经SDS-PAGE检测分析和Brandford法测蛋白浓度得出纯化的Fab抗体片段纯度在90%以上,分泌表达纯化量为0.4mg/L。以VEGF165作为结合抗原,间接ELISA分析纯化后的Fab抗体EC50=30ng/ml。继续用该培养基在3.7L体积发酵罐中进行2L体积的发酵,获得最终的菌体产率为30g/L,可亲和纯化Fab抗体量为1.94mg/L。结论:成功实现了Fab抗体片段在大肠杆菌中的高效分泌表达,且具有很高的活性,为规模化制备Fab抗体片段提供了研究依据。

循环酶法同型半胱氨酸检测关键酶CBS和CBL的开发及试剂盒研制初探

以酿酒酵母基因组为模板通过PCR分别扩增胱硫醚β合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)和胱硫醚β-裂解酶(cystathionine β-lyase,CBL)目的基因片段,经无缝克隆构建表达质粒并转化大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)。经诱导表达和纯化后,重组蛋白的纯度均达到90%,回收率均达到80%,可溶表达量分别为26 mg/L和332 mg/L。经催化活性测定,CBS的单位酶活为15 U/mg,CBL的单位酶活为72 U/mg。在此基础上初步开发了循环酶法同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)检测试剂盒,实验结果证明该试剂盒的有效性和稳定性均符合体外诊断检测的要求,其检测性能与市售进口同类试剂盒基本一致。