人粒细胞集落刺激因子cDNA的克隆与表达

用脂多糖诱导正常人外周血单核细胞使产生粒细胞集落刺激因子。从诱导细胞中提取出总RNA,以特异引物经逆转录PCR扩增出粒细胞集落刺激因子mRNA的cDNA,将其插入经改造的分泌型表达载体pIN-omp A,并转化受体菌E.coli。克隆的cDNA通过限制性酶双酶切和3′端、5′端及中间序列探针分子杂交鉴定,结果与预期一致。表达质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导,粒细胞集落刺激因子被分泌到细菌的周质中。产物提取后,用双单抗夹心ELISA法检测具有粒细胞集落刺激因子的免疫活性。

多肽的表面展示与结构库

表面展示是一种新的基因操作技术，它使表达的多肽以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞表面，保持相对独立的空间结构和生物活性。该技术可用于研究多肽（蛋白质）的性质、相互识别和作用，并据此从巨大展示库中选择特定靶功能的多肽结构。常用丝状噬菌体、Ｔ４噬菌体、λ噬菌体以及细胞构建表面展示系统。表面展示库包括重组噬菌体抗体库、随机短肽库、多肽构象库、ｃＤＮＡ展示库和基因突变体展示库。表面展示技术可用于人工抗体和疫苗的制备、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离、细胞表面工程的研究、多肽药物的研制。

DNA与RNA谁是主角?

DNA与RNA相伴而生 ,是一对孪生分子。生命起源最早出现可能是“核酸世界” ,DNA与RNA是后来分化产生的。在当今生命系统中 ,DNA、RNA和蛋白质起着决定的作用 ,成为生命系统中的三驾马车。RNA干扰的发现表明 ,生物基因表型的变化是受RNA控制的。RNA转录后复杂的加工过程反映了RNA的进化历程。因此 ,重新认识RNA已成为当前生命科学亟待解决的问题。

逆转座子和逆向遗传信息流

一、引言 遗传信息可以从基因组的一个位点转移到另一个位点,转移的信息或是由DNA所携带,或是由RNA所携带。DNA介导的转位作用在原核生物和真核生物中都能发生;RNA介导的转位作用目前仅发现于真核生物。为了与DNA介导的转位作用相区别,由RNA介导的遗传信息逆向转移称之为逆转位作用(retroposition)。

蛋白质工程的研究

对近期蛋白质工程的工作进行了综合报道，涉及到胰蛋白酶、金属硫蛋白、胰岛素、尿激酶原、组织型纤溶酶原激活剂、ＲＧＤ肽等蛋白质或多肽的结构与功能研究以及分子改造。

对生蒴蛤谷胱甘肽转移酶的光谱研究

为深入了解海洋软体生物谷胱甘肽转移酶 (GSTs)的性质和特点 ,以对生蒴蛤肝肠为材料 ,经 GSH亲和层析与反向 HPLC分离得到纯化蛋白 (ad GST) ,经 SDS-PAGE、凝胶过滤与飞行时间质谱分析确定该酶为双亚基组成 ,全酶分子量 5 0 0 0 0 ,亚基为 2 5 0 0 0 .紫外光谱分析表明 ,该酶在 2 80 nm有最大吸收峰 ;荧光光谱分析表明 ,该酶的最大激发波长为 2 80 nm,在 35 0 nm有最大发射峰 ;用圆二色谱与傅里叶变换红外光谱对该酶进行二级结构测定 ,结果表明 ,该酶含有约 35 %左右的α-螺旋 ,30 %左右的β-折叠 ,表明该酶属于典型的球状蛋白 .

利用pⅧ展示系统改进噬菌体抗体芯片

将展示单链抗体的重组噬菌体与羧基终止的硅片偶联,制成噬菌体抗体芯片,可用于检测多类蛋白质和蛋白质组.通常抗体被展示于噬菌体外壳蛋白pⅢ上,由此制备的芯片灵敏度和信噪比较低.我们选用凝血酶特异的单链抗体为代表,比较了pⅢ展示系统和pⅧ展示系统制成芯片的检测效果.由于pⅧ展示系统的融合蛋白拷贝数多,所受空间位阻小,大幅度提高了噬菌体抗体芯片的灵敏度和信噪比,有望用于制备新型蛋白质芯片.

水蛭素在噬菌体表面的展示

水蛭素是凝血酶强有力的天然抑制剂。通过改造噬菌质粒并构建水蛭素表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｇ８Ｈｉｒ，使水蛭素基因通过接头与噬菌体Ｍ１３的ｇｐ３（１９７～４０６）基因片段融合。表达产物在ｇｐ８信号肽的引导下到达大肠杆菌周质，在辅助噬菌体Ｍ１３ＫＯ７的帮助下组装到丝状噬菌体外壳上。展示在噬菌体表面的水蛭素仍然具有与凝血酶结合并抑制酶活性的作用，说明展示的水蛭素保持了正确的空间构象和生物学活性。水蛭素在噬菌体表面的功成展示为进一步开展其实验定向进化以及结构与功能关系的研究打下基础。

用于识别不同细胞蛋白质组的噬菌体抗体芯片

将4个鼠源噬菌体抗体克隆和1个人源噬菌体抗体克隆偶联到羧基终止的硅片表面,制成分析型模型芯片.挑选健康人体淋巴细胞为正常细胞的代表,HeLa细胞为肿瘤细胞的代表,提取细胞的全部蛋白质并用荧光染料Cy3标记,与制成的分析芯片反应,得到了不同的结合图谱.实验结果表明,以噬菌体抗体为分子感受器的分析芯片可用于识别不同细胞的蛋白质组.

生物进化工程

1973年,美国斯坦福大学的博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)采用 DNA 重组技术,首次获得外源 DNA 的分子克隆,从而开始了在分子水平上对遗传物质的施工和改建,即基因工程。十年之后,厄尔默(K.M.Ul-mer)提出蛋白质工程的设想,即通过对蛋白质已知晶体结构的了解,借助计算机辅助设计,用基因定位诱变等技术改造基因。

水蛭素基因的递归PCR合成和在大肠杆菌中的表达与分泌

水蛭素是凝血酶最强的特异抑制剂，可望成为预防和治疗各种血栓疾病的有效药物。根据医用水蛭（Ｈｉｒｕｄｏｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）头部水蛭素（ＨＶ－２）的氨基酸序列，通过递归ＰＣＲ，合成水蛭素基因，并重组到本实验室改建的大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ｏｍｐＡ－ＨＩ中，使水蛭素基因的编码序列直接位于大肠杆菌外膜蛋白Ａ信号肽序列的下游。转化大肠杆菌ＤＨ５α，筛选出重组体，经ＰＣＲ，限制酶切图谱和序列分析，结果表明所合成的水蛭素基因与设计完全一致。水蛭素基因在大肠杆菌中得到表达，重组水蛭素（ｒＨＶ－２）被分泌到细胞周质及培养基中，表达量占菌体蛋白的１９．８％，并且有明显抗凝血酶生物活性。经分离纯化，产物在质谱分析中显示基本为单一成分，分子量为６８９３．１Ｄａ，证明重组水蛭素在分泌过程得到正确加工。

DNA改组技术在水蛭素实验进化中的应用

Hirudin gene was mutated by error\|prone PCR and DNA shuffling.The shuffled genes were inserted into phagemid pCANTAB\|5G8.After the introduction of the recombinant DNA into E.coli TG1,the hirudin mutants were displayed on the surface of bacteriophage M13.A mutant with increased specific activity of antithrombin was selected by two rounds of panning with decreased amounts of thrombin,and was identified as N47K.Activity analysis of HV2 and its mutants N47K,N26S,D5A,P46L/S50G suggested that K47,P46 were important to the interaction of hirudin and thrombin.Hirudin mutants with improved properties could be hopefully aquired through directed evolution by DNA shuffling.

小鼠4.5S RNA逆转座子对Luc基因表达的影响

利用RT PCR方法 ,从小鼠肝脏组织总RNA中扩增出 4 5SRNA的cDNA。该cDNA被克隆到pGEM3Zf ( + )质粒上 ,酶切鉴定并测序。然后将该序列插入以Luc基因作为报道基因的表达载体pSVluc2 0的PvuⅡ位点 ,构建了含 4 5SRNA逆转座子的表达载体pSVluc2 0 4 5S。脂质体转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞NS 1、SP2 /0和人乳腺癌细胞Bca61。结果表明 ,小鼠 4 5SRNA逆转座子序列在NS 1、SP2 /0细胞中对Luc基因的表达有促进作用 ,而在Bca61细胞中对报道基因的表达则起抑制作用。

小鼠4.5SRNA逆转座子cDNA的克隆及其表达载体的构建

利用ＲＴ＿ＰＣＲ方法，从小鼠肝脏组织总ＲＮＡ中扩增出４．５ＳＲＮＡ的ｃＤＮＡ．此ｃＤＮＡ被克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）质粒，酶切鉴定并测序．然后将该序列插入以虫荧光素酶基因作为报导基因的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０的ＰｖｕⅡ位点，构建了含４．５ＳＲＮＡ逆转座子的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０＿４．５Ｓ．并对４．

不同年龄小鼠DNA熔解曲线及Tm值的比较研究

从胚胎及不同年龄小白鼠脑心肝等组织中提取出染色体基因组ＤＮＡ和染色体外基因共价闭环ＤＮＡ（ＣＣＣＤＮＡ），在２５～１００℃温度区间测定其２６０ｎｍ紫外光吸收值，绘制ＤＮＡ的熔解曲线，并确定它们变性一半时的温度，即Ｔｍ值。结果表明，脑心肝等组织ＤＮＡ的变性曲线随增龄逐渐变平缓：染色体ＤＮＡ的Ｔｍ值随增龄而下降（Ｐ＜０．０１），ＣＣＣＤＮＡ的Ｔｍ值升高（Ｐ＜０．０１），由于同一种动物不同年龄，不同组织ＤＮＡ的碱基组成变化不大，可以认为它们变性温度的变化在一定程度上反映了遗传信息丢失的情况。对这种变化与生物衰老的关系进行了讨论。

细胞间粘附分子1特异结合肽的筛选及其生物功能

采用两种方法对噬菌体展示随机十五肽库进行亲和淘选 .ELISA法筛选特异结合高亲和力的阳性噬菌体单克隆 ,测序 ,得到 6个与人细胞间粘附分子 1(ICAM 1)高亲和力的噬菌体展示十五肽单克隆 .再经ELISA法从这 6个噬菌体单克隆中选择与ICAM 1亲和力最高的单克隆 ,同时利用蛋白空间结构位象模拟技术对小肽与ICAM 1的亲和力进行模拟研究 .最终获取目的小肽的氨基酸序列为GRGEFRGRDNSVSVV .目的单克隆噬菌体与ICAM - 1的亲和常数Ka 为 7 87× 10 7L mol .体外合成、纯化并标记目的小肽 .ELISA法验证目的小肽与人ICAM 1的结合呈浓度依赖性 ,抗ICAM 1多抗不能拮抗目的小肽与ICAM 1的结合 .采用免疫组化方法证实 ,此目的小肽具有与炎症组织中高表达的ICAM 1特异性结合的功能 .在动物体内 ,荧光标记的目的小肽具有向高表达ICAM 1的炎症部位特异性聚集的功能 .说明此目的肽可尝试作为以ICAM 1为靶的“肽导向药物”的前导肽 .

利用PCR技术构建体外高效转录系统

设计并合成了一对 PCR 反应引物,其5′端引物除含有目的基因5′端序列外,还外加 T7 RNA 聚合酶启动子的17个核苷酸.3′端引物则按常规设计.以染色体 DNA为模板,通过 PCR,可扩增出带有 T7 RNA 聚合酶启动子的目的基因 DNA 片段.以此 PCR 产物为模板,在体外成功实现了高效转录.这是一种快速、简便构建体外高效转录系统的好方法.

横向塞曼激光器在生物分子检测中的应用研究

首先简述了表面等离子体共振原理、激发表面等离子体共振的条件和产生共振时反射光的相位变化 ,再对横向塞曼激光器的应用进行了分析。接着 ,基于相位检测 ,以横向塞曼激光器为光源 ,建立了生物分子相互作用检测实验装置 ,并以蓖麻毒素和羊抗小鼠抗体为样本进行了实验。实验表明 :检测灵敏度高 ;在整个光路中 ,P光与S光完全重合 ,满足共光路原则 ,对空气折射率和其它各种扰动具有很好的自适应性 ,检测稳定性好 ;激光稳频精度可达 3.5× 10 - 10 ,与光强检测法相比 ,检测可靠性更高。

肠杆菌4.5S RNA基因单链构象多态性的比较研究

本文对大肠杆菌(Escherichia coli)不同菌株和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)不同属其他三种菌株,即普通变形菌(Proteus vulgaris)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes),分别进行4.5S RNA基因聚合酶链式反应(PCR),然后对扩增产物作依赖于序列的单链构象多态性(SSCP)分析.实验结果表明,上述细菌4.5S RNA基因的大小和正链构象均无可觉察的差异,仅产气肠杆菌的负链构象有明显不同.由此可见4.5S RNA基因在进化上相当保守,产气肠杆菌4.5S RNA基因的序列虽有改变,仍能维持其有义链的基本构象.

谷胱甘肽硫转移酶结构与功能研究进展

谷胱甘肽转硫酶(G lutath ione S-transferases,简称GSTs,EC2.5.1.18)是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶,其主要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联,增加其疏水性使其易于穿越细胞膜,分解后排出体外,从而达到解毒的目的.着重介绍了近年来谷胱甘肽硫转移酶结构与功能研究的进展,详细描述并比较了多种同工酶的三级结构、生化功能、催化机制以及底物特异性,同时对GSTs种类之间结构与功能的进化做了较深入探讨.