OPS法玻璃化冷冻牛卵母细胞的研究

用自己现用现配的玻璃化溶液 (EFS4 0、EFS5 0和EDFS30、EDFS4 0 )对二步平衡后的牛体外培养的卵母细胞进行OPS(openpulledstraw)法冷冻保存研究。体外分别培养 6h或 2 2h的牛卵母细胞冷冻解冻后再经 18h或2h培养后 ,经体外受精 ,最高囊胚发育率分别达到 12 %和 17% ;经化学孤雌激活后 ,最高囊胚发育率分别达到2 2 %和 2 4 % ,与对照组 (33% )差异不显著 (P >0 .0 5 )。

小鼠原核胚OPS法冷冻保存技术

在 2 0、2 5℃室温条件下 ,采用 OPS(open pulled straw)法对小鼠原核胚进行玻璃化冷冻保存。结果表明 ,EFS和EDFS各冷冻组的原核形态正常率 (95 %～ 10 0 % )、体外发育率 (76 %～ 82 % )和对照组 (10 0 %、88% )无显著性差异 (P>0 .0 5 )。采用 EPFS4 0冷冻后的原核胚形态正常率 (70 %～ 76 % )与对照组相比差异极显著 (P<0 .0 1)。而 EPFS30和EPFS4 0冷冻后的胚胎发育率 (34%～ 5 7% )均极显著低于对照组 (P<0 .0 1)。另外 ,在 2 5℃室温条件下冷冻保存的原核胚 ,解冻后其囊胚发育率 (76 %～ 80 % )与对照组 (86 % )无显著性差异 (P>0 .0 5 )。冷冻保存的原核胚移植后的妊娠率和产仔率达 4 5 %和 4 4 % ,与新鲜原核胚移植的对照组 (5 6 %和 4 6 % )相比均无显著性差异 (P>0 .0 5 )

绵羊体内外受精胚胎玻璃化冷冻保存

用 EFS4 0溶液对绵羊体内外受精的早期囊胚进行了玻璃化冷冻保存的研究。经卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养获得的早期囊胚 ,分别作如下处理 :( A) 1 0 %EG中预处理 5min后 ,在 EFS4 0平衡 3 0 s(两步法 ) ;( B) EFS4 0中平衡 1 min(一步法 ) ;( C) EFS4 0中平衡 2 min(一步法 )。然后投入液氮中冷冻保存 ,解冻胚胎的继续发育率分别为 80 %、78%和 50 %,A、B2组的结果与对照组 ( 88%)无显著性差异 ( P >0 .0 5)。经超数排卵获得的体内受精早期囊胚用两步法冷冻保存 ,解冻后胚胎发育继续率为 89%,与对照组( 93 %)也无显著性差异 ( P >0 .0 5)

小鼠桑椹胚简易玻璃化冷冻技术再探讨

本试验继小鼠扩张囊胚玻璃化冷冻保存成功后，在室温（２５℃）下利用不同浓度的ＥＦＳ玻璃化溶液，对小鼠的桑椹胚简易玻璃化冷冻技术进行再探讨。结果是胚胎在１０％ＥＧ溶液中预先处理５分钟，再移入事先配置好含有ＥＦＳ３０的０．２５ｍｌ塑料细管中１分钟平衡后直接投入液氮中冷冻，解冻后获得的发育率最高（９４％）。冻胚移植后妊娠率和产仔率分别为５６％（９／１６）及４２％（４９／１１６）。与对照组相比差异不显著（Ｐ＞０．０５）

小鼠桑椹胚玻璃化冷冻前后生物频谱处理对体外发育的影响

本试验利用周林频谱仪（WS－302）照射玻璃化冷冻前后小鼠桑椹胚，研究对其体外发育的影响，结果表明：胚胎在10％EG溶液中处理5min后移入EFS30中处理1min的二步法冷冻组，解冻后经照射5～20min后的胚胎发育率（95％～100％）与对照组（94％）比较无显著性差异（P＞0．05）。当在EFS40中处理1min的一步法冷冻组的胚胎，照射后发育率由对照组的54％提高到97％差异极显著（P＜0.01）。改用GFS40一步法冷冻的胚胎照射后的发育率也明显高于对照组（P＜0．05）。另外，对冷冻前胚胎进行照射，其解冻后发育率（87％）也得到了显著提高（P＜0．01）。

小鼠胚胎玻璃化冷冻保存及保存时间对其体内外发育率的影响

本试验采用乙二醇为主体的ＥＦＳ４０玻璃化溶液，对小鼠扩张囊胚实行二步法玻璃化冷冻保存。结果保存１小时、１年和２年的胚胎，在体内外的发育率无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。与对照组相比较也无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。

牛体内、外受精胚胎玻璃化冷冻保存技术的研究初报

利用 3种培养液即输卵管合成液 (SOF)、TCM199和CR1aa对牛体外受精后的卵母细胞进行培养 ,结果卵裂率分别达 85 %、67%和 72 % ,囊胚发育率分别为 37%、2 1%和 30 %。对所获得的囊胚利用EFS玻璃化溶液进行冷冻保存。在 10 %EG中预处理 5min后再移入EFS 4 0平衡 30s二步法冷冻保存的胚胎 ,其解冻后继续发育率高达 86% ,与对照组 91%相比无显著性差异 (P >0 .0 5 )。而EFS 30二步法冷冻保存的胚胎发育率仅为 4 3% ,与对照组相比差异极显著 (P <0 .0 1)。体内受精早期囊胚用EFS 4 0一步法和二步法冷冻保存后的继续发育率分别为 83%和 95 % ,与对照组(97% )相比均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。

扩张囊胚玻璃化超低温冷冻保存及移植技术的研究

本试验探讨了对鼠扩张囊胚玻璃化冷冻保存后，提高发育率的最佳条件。玻璃化溶液是用ＰＢＳ液稀释成的３０％聚蔗糖＋０．５Ｍ蔗糖混合法，再将乙二醇（ＥＧ）调制成２０、３０及４０％（ｖ／ｖ）的溶液，即ＥＦＳ２０、３０及４０。玻璃化冷冻保存是１０、２０及２５℃温度下，将扩张囊胚直接移入ＥＰＳ溶液后投入液氮中一步法令冻保存，其中２５℃下保存后的发育率最高（８７％）。继之将扩张囊胚用１０％ＥＧ溶液经５分钟处理后，再移入ＥＦＳ４０中二步法冷冻保存，发育率高达９４％。利用二步法冷冻保存的扩张囊胚移植后，妊娠受体的产仔率为６６％（１６８／２５５），同时照组产仔率６１％（８０／１３２）相比无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。

小鼠原核胚玻璃化冷冻保存技术的研究

目的 原核胚是转基因等生物技术所必需的主要材料 ,其冷冻保存使操作不受时间和空间的限制。另外 ,冷冻保存还可以避免体外培养过程中的细胞发育阻断期。方法 在室温 (2 0℃或 2 5℃ )条件下 ,以乙二醇、DMSO为主体抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液 (EFS、EDT、EDFS) ,不借助冷冻仪 ,对小鼠原核胚进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存。结果 2 0℃室温条件下 ,用EDFS4 0平衡 1min一步法冷冻解冻后的原核胚 ,经培养后囊胚发育率最高仅为 4 7% ,与新鲜原核体外培养的对照组 (75 % )的差异极显著 (P <0 0 1) ;当原核在 10 %E +10 %D溶液中预处理 5min ,移入EDFS30中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后的囊胚发育率达 6 8%。而室温升至 2 5℃ ,二步法冷冻保存后原核胚的囊胚发育率高达 77% ,与对照组差异无显著性 (P >0 0 5 )。用最佳冷冻组的原核胚或解冻后培养到囊胚移植给受体母鼠均获得产仔。结论 本研究对小鼠原核胚实施玻璃化冷冻保存 ,经体外培养和移植结果与对照组无显著性差异 。

小鼠扩张囊胚细胞膜对不同抗冻保护剂通透性的测定

胚胎玻璃化冷冻保存最重要的条件是胚胎细胞膜对抗冻保护剂的通透速度，即细胞内外液保护剂达到平衡的时间。温度及抗冻剂的种类不同，其通透速度各异。本试验将玻璃化抗冻液中常用的几种抗冻保护剂，如乙二醇、两三醇、二甲基亚砜、乙酰胺及丙二醇的通透性进行比较。

家畜繁殖学实验教学的建设与成效

本文主要介绍中国农业大学动物科技学院家畜繁殖学教学团队贯彻、落实教育部《关于加强高等学院本科教学工作提高教学质量的若干意见》,推行"国家级精品课程建设"工作的重要措施和成果。总结了家畜繁殖学实验教学在实验条件、教学手段、教学内容等方面的改革方法及成效。新实验体系的实施,有利于提高学生的实践与创新能力和教师的教学质量,为深入实验实践教学提供参考。

不同群系小鼠胚胎玻璃化冷冻保存技术的研究

利用 EFS40 ,二步法对近交系 C5 7BL/6、DBA/2和远交群 ICR小鼠囊胚玻璃化冷冻保存 ,并对冷冻后胚胎体内、外发育效果进行比较。结果表明 ,相同条件下鲜胚经培养 ,近交系 C5 7BL /6小鼠的囊胚发育率 ( 93% )与 ICR( 1 0 0 % )相比差异不显著 ( P>0 .0 5 ) ;而两近交系的囊胚孵化率明显低于 ICR( P<0 .0 1 )。 C5 7BL/6、DBA/2小鼠囊胚冷冻后发育率 ( 93% ,96% )和孵化率 ( 5 2 % ,46% )与各自对照组 ( 1 0 0 % ,1 0 0 %和 61 % ,62 % )相比均无显著差异 ( P>0 .0 5 ) ;并且与 ICR冷冻组发育率和孵化率 ( 94% ,5 3% )之间也无显著差异 ( P>0 .0 5 )。两近交系冻胚移植妊娠与各自对照组和 ICR冷冻组比较均无显著差异 ( P>0 .0 5 )。C5 7BL/6胚胎移植产仔率 ( 35 % )与对照组 ( 5 1 % )之间差异显著 ( P<0 .0 1 ) ,而 DBA/2胚胎移植产仔率 ( 4 7% )与对照组和 ICR冷冻组 ( 39% ,5 8% )相比差异不显著 ( P>0 .0 5 )。

牛体外受精扩张囊胚的玻璃化超低温冷冻保存及移植技术的研究

本试验对牛的扩张囊胚的冷冻保存技术进行了探讨。在２５℃温度下，利用ＥＦＳ４０的玻璃化溶液，将扩张囊胚直接移入此液中平衡后，投入液氨中一步法冷冻保存。或胚胎移入ＥＦＳ４０之前，在１０％ＥＧ溶液中预先处理，二步法冷冻保存。其解冻后获得了较高的发育率（分别为５９％ＶＳ６３％）。冷冻保存的胚胎移植后的妊娠率及产仔率分别高于对照组（８０％ＶＳ５５％；５５％ＶＳ２３％）。

小鼠扩张囊胚低渗液处理试验

为研究解冻后的胚胎膨胀对其发育率的影响，本试验用２０～５０％的低渗ＰＢＳ溶液（即０．２０×、０．２５×、０．３０×及０．５０×），分别将小鼠扩张囊胚在低渗液中处理３０分钟后培养，结果新鲜胚在０．５０×和０．３０×中处理后的发育率分别为１００％和９１％，０．２０×处理组的发育率降低到５３％。解冻后的胚胎直接用低渗液处理，０．５０×组只有８５％继续发育，低于０．２５×组完全不能发育。而解冻后经培养恢复到扩张囊胚后再做低渗处理，０．３０×组仍有９６％继续发育。

乙二醇为主体的玻璃化溶液对小鼠桑椹胚的超低温保存

本试验系统地研究了以低毒性的乙二醇为主体，添加葡聚糖和海藻配制成的玻璃化溶液（EDT20，EDT30及EDT40），在室温（20 ℃或25 ℃）下对小鼠体内受精的桑椹胚进行玻璃化冷冻保存。毒性试验表明，30%葡聚糖溶液（D）,0.5mol/L海藻糖溶液（T），以及两种物质的混合液即DT溶液，对胚胎均无化学毒性作用，乙二醇是化学毒性的主要来源。且随着乙二醇浓度的增加和平衡时间的延长，对胚胎的化学毒性也增大。小鼠桑椹胚的玻璃化冷冻试验中，20 ℃室温下胚胎冷冻效果好于25 ℃，但差异无显著意义（P>0.05）。在20℃室温下,胚胎于EDT30中平衡1 min,后直接投入液氮中一步法冷冻后胚胎体外发育率、移植妊娠率和产仔率分别为94.00%、45.00%、38.00%，与对照组差异均无显著意义（P>0.05）。若将胚胎在10%EG中平衡5 min，再移入EDT30中平衡30 s二步法冷冻效果最佳，解冻后囊胚发育率、移植妊娠率和产仔率分别为96.00%、57.00%、52.00%,与对照组差异均无显著意义(P>0.05)。

家兔扩张囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究

本试验对家兔扩张囊胚的玻璃化冷冻保存技术进行了探讨。首先在２０℃室温下，将扩张囊胚直接移入ＥＦＳ４０溶液中短时间平衡后，直接投入液氮中冷冻保存（一步法）；或胚胎在１０％～２０％ＥＧ（或ＥＦＳ２０）溶液中经预先处理后，再移入ＥＦＳ４０中冷冻保存（二步法），解冻后的胚胎发育率达到９５％～１００％。当室温提高到２５℃时，一步法和二步法冷冻的胚胎均得到了较高的发育率（８９％～９０％）。利用２０℃条件下一步法即２分钟平衡后冷冻的胚胎移植后，妊娠受体的产仔率为２９．２％（７／２４），同对照组产仔率３２．４％（１１／３４）相比无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。

小鼠扩张囊胚颗粒法玻璃化冷冻保存技术研究

在２５℃室温下，用ＥＦＳ３０玻璃化溶液，对小鼠扩张囊胚进行颗粒法玻璃化冷冻保存。结果，胚胎在ＥＦＳ３０溶液中平衡１ｍｉｎ后滴入液氮中，解冻后的胚胎发育率达１００％，囊胚孵化率达７６％。而在１０％乙二醇溶液中将胚胎预处理５ｍｉｎ，再移入ＥＦＳ３０中平衡１ｍｉｎ后冷冻保存的胚胎，解冻后的发育率和囊胚孵化率分别为９８％和６３％。上述２组的胚胎发育率与对照组无明显差异，而囊胚发育率均明显低于对照组（Ｐ＜０．０１）。上述２组胚胎解冻后植入假孕小鼠子宫后的受体妊娠率分别为９０％和８１％，产出率分别为７１％和５８％，与对照组（６１％）相比均无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。

21世纪哺乳动物胚胎生物工程发展趋向

动物胚胎生物工程主要是指在实验室条件下,对动物胚胎进行人为干预、改造和操作,按照人们的意愿生产某种性别或特定功能动物的实践。进入21世纪以来,动物胚胎生物工程技术发展迅速,研究不断深入,在动物配子/胚胎超低温冷冻保存、MOET育种、性别鉴定与控制、转基因、克隆和胚胎干细胞分离与培养技术等研究领域取得了令人瞩目的成就,同时也突现了许多新的研究热点和存在的问题。该文围绕哺乳动物配子与胚胎生物工程中几个热点研究进行简述。

家兔孵化囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究

采用两种方法对家兔孵化囊胚作玻璃化冷冻保存：在 25℃室温下，将孵化囊胚直接移入 EFS40溶液中短时间平衡后，直接投入液氮中冷冻保存 (简称一步法 )；或将胚胎在 10％或 20％ EG溶液中经预处理后，再移入 EFS40溶液冷冻保存 (简称二步法 )。结果表明，一步法冷冻后的胚胎发育率为 68％，与对照组 (鲜胚 )的差异极显著 (P0. 05)。但无论是冻胚还是鲜胚，移植后均未获得产仔。

开展家畜繁殖学课程兴趣小组实践与探索

针对教学改革中提倡素质教育和学生全面发展的方针,组建家畜繁殖学课程兴趣小组,发掘兴趣以培养学生创新能力,激发潜能以培养学生科研意识,教学相长以优化家畜繁殖学教学体系。家畜繁殖学课程兴趣小组教学实践效果良好,理论教学与实践教学相结合,科研优势形成教学资源优势,学习能力转化为实践能力。