HLA-E基因的多态性对同胞全相合造血干细胞移植后巨细胞病毒感染的影响

本研究旨在探讨人类非典型HLA抗原E(HLA-E)对同胞全相合造血干细胞移植(HSCT)后巨细胞病毒(CMV)感染的影响。以2005年1月至2011年1月在我院行HLA同胞全相合HSCT患者119例为研究对象,采用PCR和测序方法检测供、受体HLA-E基因多态性。结果表明,HLA-E*0101/0101纯合型占20.17%,HLA-E*0103/0103纯合型占27.73%,HLA-E*0101/0103杂合型占52.10%;HLA-E*0101/0101纯合子组CMV感染15例,CMV感染率为62.50%;HLA-E*0103/0103纯合子组CMV感染16例,CMV感染率为48.48%;HLA-E*0101/0103杂合子组CMV感染20例,CMV感染率为32.25%。含HLA-E*0103基因组与HLA-E*0101/0101纯合子组患者CMV感染率比较,差异有统计学意义(P=0.0295),与CMV疾病的发生率比较,差异仍有统计学意义(P=0.0074)。结论:HLA-E基因多态性对同胞全相合移植后CMV感染和疾病的发生存在影响。

CMVPP65抗原监测无关供体造血干细胞移植后巨细胞病毒感染

目的利用免疫荧光组化方法对CMV-PP65抗原进行监测,探讨无关供体造血干细胞移植后CMV的感染率,危险因素和治疗情况。方法以37例无关供体造血干细胞移植患者为研究对象,移植14d后每周采集受者的抗凝血标本直到移植后3个月,之后每隔1～3个月采集一次受者的血标本直到移植后3年,3年后仍有CMV再次感染者继续采集患者标本,并进行动态观察。结果1、在2～50个月的随访期内,CMV首次检出的中位时间在50d,CMV病毒血症发生率59.46%(22/37)。严重GVHD患者和无严重GVHD患者CMV感染率无明显差异;2、CMV病毒血症患者对早期抗病毒治疗有效,CMV疾病发生率很低。结论无关供体造血干细胞移植后长期坚持CMV监测非常必要,有助于指导CMV病毒感染的治疗和预后评价。

基于气相色谱-质谱方法研究急性白血病患者的代谢特征差异

目的 利用代谢组学的方法探讨急性白血病患者与正常人的代谢差异.方法 收集2014年1月—2015年5月32例急性白血病患者的血浆样本,以及年龄体重匹配的20名正常人的血浆样品,通过气相色谱-质谱（GC-MS）联用的代谢组学方法研究急性白血病患者的血浆代谢物与正常人的差异.结果 急性白血病患者与正常人比较丙酮酸,丁二醇,甘油,苯乳酸,葡萄糖,半乳糖,十六酸,十八酸和胆固醇的代谢存在明显差异.结论 急性白血病患者与正常人间血浆中代谢物水平有显著变化.

肿瘤细胞系血管内皮生长因子及其受体共表达的研究

背景与目的:血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)旁分泌在肿瘤血管新生中的作用已得到证实,但其自分泌作用尚不清楚。本研究的目的是分析VEGF及其受体(Flt-1和KDR)基因在恶性肿瘤细胞系中的共表达。方法:以看家基因为内标,采用半定量逆转录-聚合酶链反应分析VEGF及其受体基因在30种肿瘤细胞系和4种内皮细胞中的表达水平。结果:在29种肿瘤细胞系和3种内皮细胞系检测到中度以上的VEGF基因表达,而人脐静脉内皮细胞仅有低表达;Flt-1基因表达分别见于50%(6/12)的血液肿瘤,28%(5/18)的实体瘤细胞和2种内皮细胞;仅在16.7%(2/12)的血液肿瘤,33.3%(6/18)实体瘤细胞和2种内皮细胞检测到KDR基因表达;而ECV304细胞并无Flt-1或KDR基因的表达。结论:VEGF基因高表达是肿瘤细胞的重要特征,而VEGF及其受体共表达表明肿瘤细胞系中存在自分泌途径。

雷帕霉素诱导Balb/c小鼠CD4^+ CD25^+ foxp3^+调节性T细胞增殖

目的探讨雷帕霉素对Balb/c小鼠CD4+ CD25+ foxp3+调节性T细胞的作用。方法取8wk龄的SPF级Balb/c小鼠30只,随机分为两组,实验组每只灌胃雷帕霉素0.4mg.d-1,对照组灌胃每天予等体积无菌水,共3wk。无菌条件下肝素抗凝心脏采血,分离脾脏,制备单细胞悬液。采用流式细胞仪检测小鼠外周血和脾细胞CD4+CD25+T细胞,实时定量PCR检测小鼠脾细胞foxp3 mRNA的表达。结果实验组小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+T细胞的比例分别为(9.95±4.65)%和(24.13±10.06)%,对照组小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+T细胞的比例分别为(5.01±1.49)%和(8.48±3.19)%,差异均有显著性(P<0.01)。实验组小鼠脾细胞foxp3 mRNA的表达水平明显高于对照组,是对照组的6.029倍,差异有显著性(P<0.01)。结论雷帕霉素能够明显诱导Balb/c小鼠体内CD4+CD25+T细胞的增殖,并能提高foxp3+ mRNA的表达。

亚砷酸钠治疗加速期慢性粒细胞性白血病的疗效观察

目的:观察亚砷酸钠治疗加速期性粒细胞性白血病(CML)的临床疗效.方法:依据外周血白细胞数,每日静脉滴注亚砷酸钠10～15mg.结果:经过平均40. 5天治疗,7例诊断为加速期慢性粒细胞白血病患者中,3例CR,4例PR,患者对亚砷酸钠均耐受良好,并见到临床与血液学及CFU-GM的明显改善,但无Ph染色体及融合基因改变.结论:亚砷酸钠可通过诱导细胞凋亡而用于CML加速期患者的临床治疗.

三氧化二砷联合木黄酮抑制CML细胞增殖的研究

目的 探索三氧化二砷 (As2 O3)联合酪氨酸激酶抑制剂木黄酮抑制慢性粒细胞性白血病 (CML)细胞增殖的效应及可能机制 ,为临床应用提供理论依据。方法 以CML细胞系K5 6 2为模型 ,通过细胞增殖检测、形态学观察、肿瘤集落形成和琼脂糖凝胶电泳手段 ,观察比较As2 O3 与木黄酮对CML细胞的增殖抑制效应。结果 经≥ 2 5 μmol/LAs2 O3 和 5mg/L木黄酮处理 2天后的K5 6 2细胞可出现增殖受抑和凋亡的形态学改变及DNA片段化 ,二者具有协同抑制作用。结论 As2 O3 与木黄酮能分别或协同抑制K5 6 2细胞生长 。

98例原发性血小板增多症Jak2基因突变的定量分析及其临床意义

为研究JAK2V617F在原发性血小板增多症(ET)患者中的发生率和突变类型,定量分析突变转录本水平并初步探讨其临床意义,采用ARMS(amplification-refractory mutation sequencing)PCR法检测JAK2V617F突变的发生率及其突变类型,采用毛细管电泳法定量分析JAK2V617F突变转录本水平。结果显示:98例ET患者中59例JAK2V617F为阳性,其中纯合突变18例。纯合突变及杂合突变患者的平均年龄均较野生型为高(p值均(0.05);18例纯合突变患者的白细胞计数高于41例杂合突变者,且二者均高于野生型(p值均(0.05)。毛细管电泳定量分析显示,纯合突变患者JAK2V617F突变转录本水平为(89.9±6.7)%,高于杂合突变患者的(57.1±6.7)%(p(0.05);年龄小于60岁患者的JAK2V617F突变转录本水平为(62.3±16.5)%,低于年龄大于60岁患者的JAK2V617F突变转录本水平为(72.4±15.8)%(p(0.05)。JAK2V617F阳性组中血栓的发生率高于阴性组,其中纯合突变者高于杂合突变者,发生血栓者的JAK2V617FF转录本水平高于无血栓者(p值均(0.05)。结论:JAK2V617F阳性与阴性ET患者有着不同的临床特征,分析其突变类型及检测其转录本水平对明确疾病状态、观察疾病进展及指导治疗有重要意义。

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡的机制探讨

本研究旨在探讨三氧化二砷 (arsenictrioxide ,ATO)诱导P2 10 Bcr AblK5 6 2细胞凋亡的发生机制。采用细胞培养、细胞形态观察、流式细胞术 (FCM )测定凋亡细胞和细胞周期 ,应用半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)分析ATO作用不同时间后K5 6 2细胞bcl XL 和bcr abl基因的改变 ,并检测胞浆细胞色素C(cytC)、半胱天冬酶 3(caspase 3)蛋白的表达。结果表明 :2 .5 μmol LATO作用 4 8小时可诱导K5 6 2细胞凋亡 ,凋亡进程中细胞胞浆内cytC蛋白浓度增高 ,caspase 3活性增强 ;RT PCR显示ATO对bcr abl基因表达无明显影响 ,但 12小时可下调bcl XL 基因。结论 :ATO通过激活胞浆线粒体下游的cytC和caspase 3激酶活性而诱导K5 6 2细胞凋亡 ,bcl XL

三氧化二砷下调慢性髓系白血病骨髓细胞VEGF的表达

为了研究三氧化二砷 (As2 O3 )对慢性髓系白血病 (CML)各期患者血管内皮生长因子 (VEGF)表达水平的影响 ,采用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测正常人和CML慢性期、加速期和急变期患者骨髓细胞经As2 O3 作用前、后培养上清液VEGF水平的变化。结果发现 ,2 0例慢性期、8例加速期和 7例急变期患者骨髓细胞培养上清液VEGF水平分别为 6 4 9.16± 382 .2 0 pg/ml,5 6 0 .2 7± 4 0 9.14 pg/ml和 5 87.18± 4 15 .2 8pg/ml,明显高于对照组的15 2 .16± 15 0 .0 9pg/ml(P <0 .0 1) ,但不同病程阶段的CML患者间VEGF水平的差别无统计学意义。慢性期、加速期及急变期CML患者骨髓细胞经浓度为 5× 10 -6mol/L的As2 O3 处理 72小时后 ,VEGF表达水平均出现明显下调 ,分别为 396 .6 6± 2 5 7.4 7pg/ml,36 3.4 2± 2 39.85pg/ml和 4 0 7.4 7± 2 19.38pg/ml,与未加As2 O3 组比较差别显著 (P <0 0 5 )。结论 :VEGF异常增高可能在CML整个发病过程中都发挥一定作用 ,As2 O3

小鼠密质骨间充质干细胞的培养及多能性研究

本研究培养小鼠密质骨间充质干细胞(MSC)并分析其免疫功能和分化潜能。分离小鼠双侧股骨和胫骨,反复冲洗,取出骨髓细胞,用胶原酶消化骨碎片,分离有核细胞并接种于6孔板。对第3代MSC进行免疫表型测定、免疫抑制功能分析及进行成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞诱导分化实验。结果表明,培养3周内可自小鼠密质骨分离高纯度的MSC,后者具有向成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞分化的潜能,具有抑制混合淋巴细胞反应的功能。BALB/c T细胞经C57BL/6 T细胞刺激后对照组液体闪烁计数仪检测每分钟计数(CPM)值为(2.56±0.31)×104,而与细胞比例为100∶1和10∶1的C57BL/6第3代密质骨MSC共孵育组的CPM值分别为(0.47±0.12)×104和(0.28±0.09)×104,MSC处理组CPM值与对照组CPM值相比差别有统计学意义(P<0.001),MSC抑制功能呈剂量依赖性。结论:小鼠密质骨富含MSC,原代培养MSC造血细胞污染程度低,具有抑制混合淋巴细胞反应功能,具有更广泛的实验研究应用价值。

血清LDH和HBDH活性检测在溶血性贫血中的诊断价值

溶血性贫血(简称溶贫)是常见血液病,其发生机制多与红细胞膜、血红蛋白和细胞内酶异常有关.

三氧化二砷逆转甲磺酸伊马替尼对K562/MDR1耐药的实验研究

目的研究三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)对蛋白酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼(imatinib mesy-late,IM)K562/MDR1耐药的逆转作用。方法应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分别检测IM对K562和K562/MDR1细胞的药敏性,计算半数抑制浓度(IC50)及IM对K562/MDR1的耐药倍数;检测ATO对K562/MDR1细胞的药敏性,计算IC50;将非细胞毒作用浓度的ATO与IM联合应用于K562/MDR1,计算此时IM的IC50以及ATO应用后的逆转倍数。应用流式细胞术比较IM单用以及与非细胞毒作用浓度的ATO联合应用后,对K562/MDR1凋亡率的影响,分析ATO对IM敏感性的影响。结果IM存在对K562/MDR1耐药的现象,与亲本K562细胞比较,其耐药倍数为2.51,采用非细胞毒作用的ATO对IM的逆转倍数为1.86,并可提高IM对K562/MDR1的凋亡率。结论IM存在对K562/MDR1的耐药现象,ATO可有效逆转IM耐药,并可增强IM对K562/MDR1细胞的诱导凋亡作用。

三氧化二砷对慢性髓细胞性白血病VEGF表达的影响

目的 研究慢性髓细胞性白血病(ＣＭＬ)患者血管内皮生长因子(ＶＥＧＦ)的表达及三氧化二砷(Ａｓ２Ｏ３)对其表达的影响。方法 采用酶联免疫吸附法(ＥＬＩＳＡ)检测正常人和初治ＣＭＬ患者骨髓细胞及ＣＭＬ细胞系Ｋ５６２细胞培养上清液中ＶＥＧＦ的含量。结果ＣＭＬ患者(ｎ＝２０)骨髓细胞培养上清液ＶＥＧＦ浓度为 ６４９．１６ｐｇ/ｍｌ,明显高于正常对照组的 １５２．１６ｐｇ/ｍｌ(Ｐ＜０．００１),而 ５×１０－６ｍｏｌ/ＬＡｓ２Ｏ３可明显降低ＶＥＧＦ的表达水平(Ｐ＜０．０５);细胞系Ｋ５６２有ＶＥＧＦ的过高表达,Ｋ５６２经２．５×１０－６ｍｏｌ/Ｌ及５×１０－６ｍｏl/Ｌ浓度Ａｓ２Ｏ３处理７２小时后ＶＥＧＦ浓度分别下降６６．４%和 ７８．０%。结论 ＶＥＧＦ在 ＣＭＬ患者骨髓细胞存在高表达;Ａｓ２Ｏ３可能通过抑制 ＶＥＧＦ的表达而阻断血管形成。

慢病毒介导RNA干扰血管内皮生长因子基因增强K562细胞对STI571敏感性

目的:探讨慢病毒载体介导RNA干扰(RNAi)抑制血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响。方法:构建靶向VEGF基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,与慢病毒包装质粒通过脂质体转染至293T细胞,包装产生的病毒液感染K562细胞。采用实时荧光定量PCR、Western blotting、ELISA等方法检测RNAi对K562细胞VEGF mRNA和蛋白表达的影响;台盼蓝拒染法和MTT法分析转导VEGF-shRNA对K562细胞增殖的影响;流式细胞术检测经STI571(甲磺酸伊马替尼)作用后细胞凋亡变化情况。结果:构建VEGF基因shRNA慢病毒载体(pRNAT-shRNA),并成功将其导入K562细胞。与K562和K562-con(转导空载体)组细胞相比,转导pRNAT-shRNA的K562-shVEGF细胞VEGF mRNA和蛋白表达均显著下降;生长曲线提示K562-shVEGF细胞增殖速度减慢;在STI571作用下,K562-shVEGF细胞凋亡率较K562和K562-con组细胞明显增高(P<0.05)。结论:慢病毒载体介导的VEGF基因RNA干扰可有效抑制K562细胞增殖,并能够增强细胞对STI571的敏感性。

清髓性和非清髓性干细胞移植后树突状细胞亚群的动态观察

探讨不同预处理方法移植后树突状细胞亚群早期重建情况。采用三色流式细胞仪动态检测不同移植方法后早期患者外周血树突状细胞亚群DC1(Lin-HLA-DR+CD11c+)、DC2(Lin-HLA-DR+CD123+)水平。结果:清髓性干细胞移植组包括同胞全相合干细胞移植和HLA半相合移植,移植后14dDC1分别为0.093%±0.091%,0.090%±0.064%,DC2为0.056%±0.026%,0.130%±0.036%,二者差别无统计意义。非清髓性干细胞移植组移植后14dDC1为0.223%±0.084%,DC2为0.360%±0.023%,非清髓性干细胞组DC1、DC2略低于正常对照组,和清髓性移植组相比,非清髓性干细胞组明显增高,P<0.05,二者差别有统计学意义。移植前的预处理方案强度影响树突状细胞亚群重建。

木黄酮作用于K562细胞机制的初步研究

目的:探讨酪氨酸激酶抑制剂木黄酮（Genistein）作用于慢性粒细胞性白血病（CML）的机制。方法:通过细胞增殖、活力检测、形态学观察、半固体集落培养及DNA凝胶电泳和流式细胞术,观察木黄酮对K562细胞生长的影响。结果:（1）经≥5mg/L木黄酮处理2d的K562细胞,增殖抑制率达到50％以上,且与作用剂量和时间呈正相关;形态渐趋向凋亡但体积涨大;（2）K562细胞集落抑制达50％时的木黄酮浓度为10mg/L,也与时间和剂量呈正相关;（3）K562细胞经10mg/L木黄酮处理4d,DNA凝胶电泳可见清晰的梯状条带;（4）K562细胞分别经2.5mg/L和10mg/L木黄酮处理1d和2d后,流式细胞术检测细胞凋亡率分别为0.62％、1.64％、2.71％和0.68％。4.09％、8.4％;2d后G2期细胞分别占总细胞数的17％、34.5％和79.5％,而G1期和S期细胞逐渐明显减少。结论:木黄酮对K562细胞具有显著的抑制增殖作用,其机制与诱导凋亡有关。

急性非淋巴细胞白血病患者c-kit受体表达及其功能的研究

目的：研究c-kit受体(c-kit receptor,c-kit R)在急性白血病(acute leukemia,AL)的表达,探讨c-kit R的功能是否异常。方法：运用流式细胞术(flow cytometry,FCM)分别检测92倒急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)和81例急性非淋巴细胞白血病(acute nonlymphoblastic leukemia,ANLL)患者骨髓单核细胞(bone marrow mononuclear cell,BMMNC)跨膜c-kit R表达的阳性率和阳性水平；采用干细胞因子(stem cell factor,SCF)、重组人白介素3(recombinant hu- man interIeukin-3,rhIL-3)和重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)三种造血生长因子(hematopoi- etic growth factor,HGF)共培养4例正常人和8例ANLL组患者BMMNC,二组分别设HGFs培养前的标本为对照组,运用FCM分别检测正常人和ANLL二组的对照组以及HGFs培养后第4、8和12小时3个时间点的c-kit R阳性率和阳性水平。结果：①ANLL组患者c-kit R表达的阳性率及阳性水平均值分别为71.6%和(45.3±16.50)%,均明显高于正常人和ALL组患者(P值分别＜0.001)；②4例正常人对照组(HGFs培养前)的c-kit R阳性水平均值为(3.90±0.99)%；HGFs培养后第4、8和第12小时的c-kit R阳性水平分别为(5.8±4.05)%,(7.3±6.10)%和(8.3±5.20)%,与对照组之间无统计学意义的差异(P＞0.05),8例ANLL对照组(HGFs培养前)的c-kit R阳性水平的均值为(45.6±15.08)%,HGFs培养后三个时间点的c-kit R阳性水平的均值分别为(6.1±2.78)%、(5.8±2.58)%和(5.5±2.48)%,都低于对照组(P分别＜0.001),c-kit表达呈总体下调趋势。结论：c-kit R可作为AL的髓系免疫学标志物；HGFs对ANLL患者c-kit R的调控异常,提示在ANLL高表达的c-kit R的功能异常。

VEGF基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建血管内皮生长因子(VEGF)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法将靶向VEGF基因的shRNA表达序列连接到慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti中,获得pRNAT-shVEGF质粒,经PCR和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pPACKH1通过Lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度。结果PCR扩增和测序结果证实,VEGFshRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为3×107pfu/ml。结论成功构建人VEGF基因RNAi慢病毒载体,为研究其在白血病细胞中的生物学功能和基因治疗奠定基础。

白血病单倍型骨髓移植后T细胞克隆的T细胞受体分子特征

背景与目的:临床及实验研究结果表明,异基因造血干细胞移植后T细胞免疫恢复延迟,单倍型造血干细胞移植免疫重建与临床经过密切相关。本课题通过T细胞受体谱型分析,研究白血病单倍型骨髓移植后细胞免疫重建特点及与移植物抗宿主病(GVHD)相关的T细胞克隆的T细胞受体β链可变区互补决定3区(TCRBV CDR3)分子特征。方法:应用RT-PCR扩增9例不同类型白血病单倍型骨髓移植后患者及5名正常供者的外周血的TCRBV24个家族的基因序列,并通过基因扫描的方法判断TCRBV家族的克隆表达情况、CDR3克隆性质及测定BV家族的利用率。对于单克隆表达的与GVHD相关T细胞克隆进行序列测定。结果:在移植后10～19个月,TCRBV家族的利用仍处于不均一状态,检测到部分BV家族缺失,部分家族出现寡克隆、单克隆T细胞增殖。在疾病相对稳定的4例患者中,在9～14个BV家族中有表达,且多克隆家族的表达率在50%以上。另5例为疾病处于活动状态,发生Ⅱ～Ⅲ度GVHD或巨细胞病毒(CMV)感染,对BV家族的利用明显减少,多为单克隆或寡克隆表达,多克隆表达率仅30%,未发现共用的单克隆BV家族。其中2例患者在治疗前后不同时间,随着疾病趋于稳定,BV家族的利用增加,CDR3的多克隆群体增加。得到的一组与GVHD直接相关的TCRBV CDR3分子,通过比较未发现共同使用的氨基酸基序。结论:单倍型骨髓移植后10～19个月,在疾病相对稳定期,9～12个BV家族有表达,以多克隆家族表达为主。在疾病活动状态,BV家族表达减少,以单克隆或寡克隆表达为主。与GVHD相关的克隆性T细胞,未发现共同使用的CDR3氨基酸基序。