兔胚胎的一些与分离胚胎干细胞有关的生物学特征

为获得具有发育全能性的胚胎干细胞（ＥＳ细胞），对３日龄、３．５日龄和４日龄家兔胚胎的形态结构和免疫组化特征进行了观察。家兔胚胎的外围，不仅有透明带，还包有一层很厚的胶膜。３日龄兔胚为桑椹胚；３．５日龄胚胎已出现囊胚腔，囊胚腔较小，扩增内细胞团（ＩＣＭ）占据囊腔的１／２～２／３；４日龄为囊胚，囊腔扩大，ＩＣＭ与囊胚腔的体积比值缩小。桑椹胚的卵裂球和３．５日龄、４日龄胚胎的ＩＣＭ，以碱性磷酸酶染色和胚胎阶段特异性细胞表面抗原－１（ＳＳＥＡ－１）免疫荧光标记均呈强阳性，说明它们是由未分化的细胞构成。因此，从保证全能性的角度考虑，３日龄、３．５日龄和４日龄的家兔胚胎，均可用于ＥＳ细胞的分离。

家兔囊胚在饲养层上的生长行为

研究了家兔囊胚在饲养层上的生长行为。结果表明，滋养层细胞铺展后，形成一层透明的膜状结构。覆盖在内细胞团之上。内细胞团在培养４８小时后，可见到一定程度的增殖，第３天增殖速度加快。生长的内细胞团可呈团状、条状、网状和混合型四种形态。混合型内细胞团分化出现较早，呈团状、条状和网状生长的内细胞团分化较晚。团状内细胞团一般在原位生长，而呈条状和网状生长的内细胞团增殖很快并迅速扩展到各处。滋养层细胞覆盖于未分化的内细胞团表面，剥离滋养层后，内细胞团迅速分化，说明滋养层具有保护兔胚内细胞团，减小外界环境对其诱发分化的作用。

兔和小鼠早期胚胎ICM在ES培养系统中行为的比较

比较了兔和小鼠早期胚胎在小鼠ES培养系统中生长和发育的特征。结果发现 ,“两者在体外的早期发育程序和时间表”基本一致。但两者的生长方式不同 :( 1 )小鼠胚胎的滋胚层 (TB)能推开饲养层 (feeder)直接铺展在培养皿上 ;兔胚的TB推开饲养层的力量较小 ,大多数胚胎铺展在饲养层之上 ;( 2 )小鼠胚外内胚层 (ExEn)分化后紧紧包裹在ICM (innercellmass)之外。而兔胚ExEnⅠ和Ⅱ依次从ICM分化出来 ,迁离ICM呈单层生长。故小鼠的ICM生长在自己营造的一封闭的、保护良好的微环境中。而兔胚ICM直接与饲养层接触没有任何保护措施。在现有的ES培养系统中 ,小鼠ICM呈聚集生长并正确表达AKP和SSEA 1 ,而兔胚ICM生长呈多态性。根据AKP和SSEA 1的表达以及细胞分化的程序说明 ,只有聚集生长者为兔胚ICM的正常态 ,迁移型和单层生长的ICM为异常态。说明现有的ES培养系统对兔胚可能有不利因子存在 ,应进一步改善。本文已为筛选最佳培养条件提供了正负选择的指标。

家兔胚泡ICM在体外培养系统中的行为

一、用显微外科方法从兔早期胚泡分离来的ICM在所用的体外培养系统中的行为,因ICM的生长状态而不同。呈带状生长的ICM从近端向远处延伸,而细胞的分化则从远端逐渐向近端进行,它具有明显的极性。细胞的分化秩序井然,层次分明。因此呈带状生长的ICM适用于进行细胞分化和细胞谱系的研究。二、呈团块状生长的ICM,没有明显的极性,细胞分化开始于团块的外表面,逐渐向中央进行。细胞分化开始稍晚一些,速度也较慢,这种生长状态的ICM适用于分离胚胎干细胞。三、兔子胚外内胚层从ICM分化来,它经历了二次分化的过程。第一次发生于培养后第三天(相当于交配后第七天),形成第一胚外内胚层-胚外体壁内胚层,它向远处迁移,远离原始外胚层。培养后四天(相当于交配后第八天),形成第二种胚外内胚层-胚外脏壁内胚层,它尾随体壁内胚层向远处迁移,其后缘的部分细胞向原始外胚层附近的滋胚层下面侵润。四、胚外体壁内胚层和脏壁内胚层的细胞是由少数决定了的和离开ICM的细胞分化和增殖而来。五、文中讨论了早期胚胎细胞分化的谱系问题。

斑马鱼shh启动子指导绿色荧光蛋白基因在脊索中的表达

体外实验业已证明shh基因的启动子受HNF3β蛋白直接调控。为研究斑马鱼shh启动子在体内的作用模式 ,构建了由 5 38bp斑马鱼shh启动子 (包含两个HNF3β结合位点 )与绿色荧光蛋白EGFP组成的表达载体 ,命名为pShh EGFP。将pShh EGFP注射到斑马鱼 1 细胞期内的受精卵中 ,定期在倒置荧光显微镜下观察GFP的表达。GFP在原肠作用期就开始表达 ,主要发生在中轴下胚层中 ;在体节形成期 ,GFP在脊索细胞中表达 ,但未发现在神经底板细胞中表达。由此可见 ,含两个HNF3β结合区域的 5

Cwc15家族同源基因mED1在小鼠早期胚胎发育中的表达模式(英文)

RNA选择性剪接机制涉及基因表达模式的多样性、胚胎发育的调控和疾病的发展与转归.Cwf15/Cwc15蛋白家族与RNA剪接体的功能相关,其基因序列在很多物种之间是十分保守的.然而,在哺乳类,Cwf15/Cwc15基因的表达模式和生物学功能研究至今未见实验性研究报道.本文首次报道了Cwc15家族同源基因mED1在小鼠早期胚胎发育过程中的表达规律.RT-PCR结果表明,mED1基因的转录水平从小鼠桑葚胚到器官形成期呈逐渐上升趋势;整体原位杂交结果显示mED1基因主要在小鼠6.5-dpc胚胎的ICM、8.5-dpc胚胎的神经褶衍生物和10.5-dpc的头部、鳃弓和体节中表达.说明mED1基因参与了小鼠胚胎的早期发育.此外,GFP-融合蛋白的亚细胞定位实验表明,mED1蛋白具有核定位的功能(剪接体蛋白的必要特性),验证了其核定位序列(NLS)的预测.本文是关于Cwc15家族基因的首次实验研究报道.

mED2——一个小鼠胚胎发育的新基因(英文)

克隆参与胚胎发育的新基因并研究其表达规律和功能是揭示胚胎发育的基因调控机理的重要途径。囊胚形成和原肠形成是哺乳动物胚胎发育过程中的两个关键阶段。囊胚阶段发生了胚胎的第一次分化,是细胞多能性和分化的一个转折点。此时涉及的基因活动,既有维持胚胎干细胞全能性或多能性的基因活动,又有按照预定发育模式参与胚胎定向分化的基因活动。原肠期是胚胎发育过程中的第二个关键转折点,涉及到3个胚层的形成和细胞命运决定等多种变化。在这个时期胚胎获得了胎儿原基的所有信息,新组织的产生和细胞迁移的再生组织与形态发生、细胞增殖、细胞分化、模式形成等存在着非常复杂而相互协调的关联。大多数细胞正由原来的多潜能逐渐向寡潜能发展,控制组织器官形态建成的基因正逐渐开启。这两个时期的基因表达图式、特征和种类会有很大的差异和变化,因此研究这两个时期的新基因的表达规律和功能,将是了解胚胎发育的基因调控机理的重要途径。文章以这两个时期胚胎为原始材料,利用减法杂交方法克隆到一新的小鼠胚胎基因mED2,对其进行了表达规律和生物学功能的初步分析。RT-PCR-Southern和原位杂交实验表明,mED2基因转录水平具有发育阶段的依赖性;随着发育过程的进行,其表达主要在胚神经系统和中胚层衍生的组织表达。mED2基因活性的knockdown对于合子的卵裂和植入前早期胚胎发育均有抑制作用。亚细胞定位实验表明,mED2基因编码的蛋白基本定位于细胞核膜及其临近的内膜细胞器(粗糙内质网和高尔基体)。根据生物信息学分析,mED2蛋白可能为一跨膜蛋白且与含有硫氧还蛋白结构域的蛋白有部分匹配。由此推测mED2基因参与了小鼠植入前早期胚胎发育,其基因产物可能通过蛋白之间的相互作用,即对蛋白进行后期修饰、折叠及行使分子伴侣等作用来活化或抑制其靶蛋白的活性,进而参与小鼠的早期胚胎发育。

MUTAGENICITY AND CARCINOGENICITY OF FISH SAUCE FROM A COUNTY WITH THE HIGH RISK FOR GASTRIC CANCER IN CHINA

The mutagenicity and carcinogenicity of fish sauce (FS) sample from Changle County, a high gastric cancer mortality (113.20/105) area, were investigated with the biologic short-term tests and laboratory animal experiment. The results showed that the extract of FS was markedly direct mutagenic toward S. typhimurium TA100, induced high sister chromatid exchanges (SCE) and micronucleus (MN) in V79 cells after nitrosation with sodium nitrite. But the non-nitrosated FS did not. The nitrosated fish sauce (NFS) also induced SOS in E. coli PQ37 and alkylation of calfthymus DNA. The potency of NFS to induce unscheduled DNA synthesis (UDS) in human normal gastric mucosal cells was increased about fivefold compared with FS. When the NFS extract was given to newborn rats by gavage, dys-plasia and adenocaroinoma were induced in the glandular stomach in the 4th and 16th experimental week, respectively. N-nitrosamides were also found in NFS, which may account for the mutagenicity and carcinogenicity of NFS. It is indicated that FS, a traditional daily eaten seasoning, may contribute to the causes of the high gastric cancer mortality for the local residents.

中国胃癌高发县鱼露的致突/致癌性研究

通过生物学短期试验和动物诱癌实验,我们研究了我国胃癌高发区福建长乐县(男性胃癌标化死亡率达113.20/10~5)鱼露的致突致癌作用。结果表明,鱼露经亚硝化后其乙酸乙酯萃取物具有明显的直接诱发S.typhimurum TA100回变、诱发V79细胞姐妹染色单体交换(SCE)和微核:诱发大肠杆菌PQ37SOS、使小牛胸腺DNA烷化的作用,并且能诱导人正常胃粘膜细胞DNA程序外合成(UDS),给新生Wistar大鼠灌胃后第四周和第十六周分别发现能诱发腺胃粘膜不典型增生(5/5)和腺胃癌(1/5);而未经亚硝化鱼露无此作用或作用很弱。进一步分析发现亚硝化鱼露中有N-亚硝酸胺(30,9-6.04μm),这类直接致灾致癌物的存在可能是亚硝化鱼露致突致癌作用的原因。长期食用鱼露可能与当地胃癌高发有关。

核定位蛋白基因在转基因小鼠制备中的应用

采用细胞质共注射方法，将目的基因表达构件牛α－ｓ１－ｃａｓｅｉｎ－ｈＧ－ＣＳＦ和哺乳类核定位基因表达构件导入受精卵细胞质，利用核定位蛋白的定向迁移功能， 将目的基因表达构件带入原核，获得转基因小鼠．这种转基因途径不仅可以提高转基因小鼠的出生率，而且整合率达５８％（２９／５０），表达率达７５％，用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法初步估算表达水平在６０～５５０ｍｇ／Ｌ乳清．因此这种转基因方法可以替代受精卵原核注射的转基因方法，且效率高、方法简单、实用，便于推广．

MNNG诱发新生大鼠腺胃癌模型的建立及其在胃癌发病机制研究上的应用

通过给新生Ｗｉｓｔａｒ大鼠连续１０次（每日１次）１－甲基－３－硝基－１亚硝基肌（ＭＮＮＧ）灌胃，成功地诱发出腺胃癌、腺瘤和异型增生等病变。在０．４ｍｇ／只剂量组，这三种病变的诱发率分别为３９％、５０％和１００％，腺胃癌的诱发率与ＭＮＮＧ剂量成正比，雄性大鼠高于雌性（Ｐ＜０．０２），７０％病变发生在胃窦部。本模型具有致癌物用量小、易定量、给药期短、省时省力和不易污染环境等优点。研究还发现６个腺胃癌中有４个ＤＮＡ具有使ＮＩＨ／３Ｔ３发生恶性转化的作用，这种转化表现为对Ｂａｌｂ／ｃ裸鼠有致瘤性，提示在这种腺胃癌ＤＮＡ中存在转化基因。

金鱼母体因子β-catenin cDNA的克隆及在胚胎发育中的作用

核质相互作用一直是动物胚胎发育领域的研究焦点,母体因子对于脊推动物胚胎发育的启动具有决定性作用。在已有的研究中,直接研究母体因子β-catenin基因的时空表达规律与其功能的相关性还较少见,因此,我们对该基因在金鱼胚胎发育全程中的作用进行了时空性的跟踪研究。报道了金鱼β-catenin cDNA全基因序列,并与斑马鱼的β-catenin cDNA序列和氨基酸序列进行了比较,结果表明,两者具有很高的同源性,分别为93％(2227/2384 bp)和98.5％(768/780 aa);系统地研究了β-catenin基因在金鱼胚胎发育全过程中的表达规律;用反义RNA和绿色荧光蛋白基因共注射技术,直接活体考察了β-catenin基因活性对金鱼胚胎发育的影响,结果证明,β-catenin在胚胎中的分布是动态的,主要定位于体轴和背部组织,以及头尾结构。β-catenin活性的丧失,导致胚胎背部结构严重缺损和沿前后轴组织发育受阻,并在幼体形成前死亡,说明该基因是胚胎启动和发育的必要因子之一。

在化学致大鼠胃癌过程中多种癌基因表达的变化

为探讨癌基因在胃癌发生过程中的作用,采用免疫组化技术,对N-亚硝酰胺诱发的大鼠胃腺癌、腺瘤、异型增生、慢性萎缩性胃炎和正常粘膜中c-ras、c-erbB-2和myc基因蛋白表达水平进行了比较。结果显示,这几种蛋白可存在于上述不同病变粘膜中,c-ras p21在腺癌中的检出率最高(7/23,30.4％),其检出水平与病变的严重程度呈正相关(P<0.05);c-erbB-2 p185和myc p62的检出率均以慢性萎缩性胃炎最高(51.5％和84.6％);同时存在3种基因产物的组织以腺癌比例最高(17.4％)。另外还发现,这些基因在胃窦侧粘膜中的表达高于嵴侧(P<0.05)。本研究结果提示c-ras可能作用于癌变全过程,myc和erbB-2可能在癌变早期发挥作用。