人骨形成蛋白3在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化及其诱骨活性检测

为了在昆虫杆状病毒系统中表达人骨形成蛋白 3(humanbonemorphogeneticproteoin3,hBMP3) ,检测表达产物的诱骨活性 .将hBMP3全长cDNA 1416bp克隆入转移载体K8中 ,再与病毒DNA经脂质体包裹后转染昆虫细胞Sf9.重组病毒经蓝白筛选后 ,用PCR方法扩增目的基因片段进行初步鉴定 .收集重组病毒的转染上清 ,肝素亲和层析纯化目的蛋白 .SDS PAGE和Western印迹进一步鉴定此蛋白 .体外培养MC3T3 E1细胞 ,经目的蛋白刺激后 ,检测细胞内碱性磷酸酶 (ALP)活性 .并将目的蛋白进行小鼠体内肌肉包埋实验 ,检测其异位诱骨活性 .结果显示 ,肝素亲和层析可以收集 1个高的洗脱峰 .SDS PAGE显示 ,非还原型样本为 32kD的二聚体蛋白带和少量 16kD单体蛋白带 ;还原型样本仅有相应大小的单体蛋白带 ,纯度达 80 % .Western印迹在相应位置呈阳性染色 .此蛋白刺激小鼠成纤维细胞 4 8h后 ,胞内ALP的活性增高 ,经rhBMP3作用后的细胞MTT染色减弱 .在小鼠股部肌肉内包埋蛋白样品 2～ 3周 ,组织学检测有成骨组织生成 .说明hBMP3在此套系统中获得了表达 .表达产物在体外可以刺激成骨细胞的分化 ,却抑制细胞的增殖 .

重组人骨形成蛋白-2对细胞成骨分化的作用

目的进一步探讨ｒｈＢＭＰ－２的促细胞成骨分化作用，以期找到合适的成骨分化标志作为ｒｈＢＭＰ－２的定量活性测定指标。方法 首先表达制备ｒｈＢＭＰ－２，用小鼠股部肌袋包埋法进行诱骨活性实验，然后检测ｒｈＢＭＰ－２作用后的骨髓基质细胞（ＭＳＣ）、ＮＩＨ３Ｔ３和Ｃ２Ｃ１２等３种细胞的碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙素（ＯＣ）、细胞总蛋白合成量以及细胞增殖的变化。结果 ｒｈＢＭＰ－２具有良好的诱导骨形成的活性，可增加３种细胞的ＯＣ含量和蛋白合成量，对ＭＳＣ的ＡＬＰ活性变化影响明显，且可促进ＭＳＣ的增殖，抑制ＮＩＨ３Ｔ３细胞的生长。结论 ｒｈＢＭＰ－２具有促进上述细胞向成骨细胞分化的作用；在一定剂量范围内，ｒｈＢＭＰ－２的作用与细胞骨钙素合成量的增加呈线性正相关，故定量测定ＯＣ的含量基本可反映ｒｈＢＭＰ－２的活性。

重组人骨形成蛋白-3成熟肽的表达、纯化及诱骨活性的研究

推测人骨形成蛋白３羧基端的１２７氨基酸的肽段为其成熟肽（ｈＢＭＰ３ｍ）。将编码此成熟肽的ｃＤＮＡ插入含ＰＬ启动子的表达质粒ｐＤＨ中，构建表达质粒ｐＤＨＢ３ｍ，转化大肠杆菌ＤＨ５α。４２℃热诱导６ｈ后表达量达到最高水平，约占菌体总蛋白２８％；表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后，溶解于尿素，在变性溶解状态下经阳离子交换层析，目的蛋白纯度至少在９５％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白３成熟肽（ｒｈＢＭＰ３ｍ）植入小鼠肌肉间隙，于不同时间取材观察，在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程，证实所制备的ｒｈＢＭＰ３ｍ具有明显的异位诱骨活性。

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因。

部分骨钙素启动子控制荧光素酶基因真核载体的构建及表达

目的 构建部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体 pc DNA3- OCP- L uc,转染细胞后检测报告基因对 rh BMP- 2的反应 ,以期用于 rh BMP活性的定量测定 .方法 用 PCR方法扩增骨钙素部分启动子 14 7bp,克隆入p GEM- 3zf(- )中 ,经酶切鉴定和序列分析正确后 ,亚克隆入能稳定高效表达荧光素酶的真核表达载体 pc DNA3- L uc中 ,构建真核表达载体 pc DNA3- OCP- L uc,然后分别将 pc DNA3-L uc和 pc DNA3- OCP- L uc转染细胞 ,并检测其对 rh BMP- 2的反应 .结果 成功构建了部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体 pc DNA3- OCP- L uc;转染细胞后其报告基因的基础活性较 pc DNA3- L uc大为降低 ,而且报告基因的表达与 rh BMP- 2剂量在一定范围内成线性正相关 .结论 真核表达载体 pc DNA3- OCP- L uc的报告基因表达具有特异性 ,可代替直接测定骨钙素用于 rh BMP- 2活性的定量测定研究 .

骨形成蛋白诱导型真核载体的构建及其表达

成骨分化相关基因骨钙素 (OC)等的启动子内均含有成骨特异性转录因子Cbfa1特异性作用元件 ,而骨形成蛋白 (bonemorphogeneticprotein ,BMP)的促成骨分化作用正是通过其首先引起Cbfa1的升高 ,而后Cbfa1激活这些基因的表达 ,最终出现成骨分化表型 .为解决BMP没有理想的活性测定方法的问题 ,在RT PCR结果证实BMP 2可促进NIH3T3和C2C12细胞Cbfa1表达后 ,构建了串联6个Cbfa1作用元件的小鼠OC部分启动子 (6OCP)控制萤光素酶 (luciferase)报告基因的真核表达质粒 ,以期来放大BMP诱导报告基因表达的作用效果 .即通过细胞转染、rhBMP 2刺激后检测萤光素酶活性变化 ,从而间接定量测定rhBMP 2的生物学活性 .结果表明 ,pcDNA3 6OCP Luc转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3 Luc大为降低 ;而且在一定剂量范围内 ,转染细胞的萤光素酶活性 (荧光值 )随rhBMP 2剂量增加而升高 ,并呈线性正相关 。

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的扩增、克隆和序列测定

骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)作为TGF-β超家族成员,可以诱导未分化的间质细胞向软骨细胞分化,然后通过软骨内成骨形成骨组织,对难治性骨折的愈合及各种骨缺损的修复有明显的促进作用。另外,BMP在胚胎发生和神经发育过程中也起重要作用。但是由于BMP在骨组织中含量甚微,提取方法繁琐,故不能满足临床应用和基础研究需要,随着人BMP(hBMP)1～13 cDNA基因的克隆,人们已在COS。

小鼠4-1BBL cDNA的克隆和表达及其抗肝癌的免疫作用

目的 :克隆小鼠 4 1BBL基因 ,构建其真核表达载体 ,并观察其在抗肝癌免疫中的作用。方法 :取C5 7BL/6小鼠脾细胞 ,经PHA诱导后 ,以RT PCR克隆 4 1BBLcDNA ,测序 ,构建真核表达质粒 pcDNA3.1(+) m4 1BBL。以重组体转染小鼠肝癌细胞Hepa1 6 ,经G4 18筛选后 ,以RT PCR、间接免疫荧光及流式细胞仪 ,检测m4 1BBL以获得稳定高表达克隆。然后将其制成肿瘤细胞疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养 ,采用MTT比色法测定淋巴细胞的特异性杀伤活性。结果 :从小鼠脾细胞中克隆到m4 1BBLcDNA ,经测序完全正确。所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+) m4 1BBL ,在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中获得稳定高效表达。与野生型Hepa1 6细胞相比较 ,m4 1BBL基因转染的Hepa1 6细胞疫苗能较有效地诱导淋巴细胞产生针对野生型Hepa1 6细胞的特异性杀伤活性 (P <0 .0 1)。结论 :将m4 1BBL基因导入肝癌细胞中表达 ,能提高其免疫原性 。

带绿色荧光蛋白标签的人era真核表达载体的构建及人Era对细胞形态和细胞周期的影响

目的 :构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法 :构建带绿色荧光蛋白 (EGFP)标签的人era真核表达载体 ,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果 :无论EGFP融合于人Era的C端或N端 ,融合蛋白均表达于细胞浆接近核膜处 ,细胞形态无明显变化 ,细胞周期检测S期细胞所占百分数降低。结论 :人era可能参与细胞周期调控 ,为阐明人era的功能提供了资料。

人骨保护素(OPG)重组腺病毒的制备及其生物活性研究

采用RT PCR法得到人OPG的编码区cDNA ,克隆至穿梭质粒pShuttle,构建重组有OPG编码区cDNA的腺病毒DNA ,经PacI酶切线性化 ,在脂质体介导下转染HEK2 93细胞 ,制备重组腺病毒并测定病毒滴度约为 5× 10 6 ～1 5× 10 7pfu mL。体外感染小鼠成肌细胞C2C12 ,Westernblot及ELISA检测证实有OPG蛋白的表达 ,并可在细胞培养上清中持续表达 6周。感染OPG重组腺病毒的C2C12细胞生长状态良好、细胞周期无明显变化。将重组腺病毒加入体外培养的小鼠骨髓细胞的培养基中 ,诱导形成的破骨细胞数量及在象牙片上形成的吸收陷窝的数量显著减少 (P <0 0 1)。

转4-1BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗刺激脾细胞产生细胞因子的研究

目的研究转4-1BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗体外刺激同系小鼠脾细胞产生细胞因子(IL-2、TNF-α和GM-CSF)的能力。方法以丝裂霉素C(MMC)处理高表达转m4-1BBL基因的小鼠Hepa1-6肝癌细胞,制成肿瘤细胞瘤苗(TCV),体外与同系小鼠脾淋巴细胞共同培养后,观察其对脾细胞产生细胞因子(IL-2、TNF-α和GM-CSF)的影响。结果TCV-4-1BBL刺激后,脾细胞体外分泌细胞因子IL-2、TNF-α和GM-CSF的水平明显增高。结论转4-1BBL基因的小鼠肝癌细胞瘤苗能刺激脾细胞产生细胞因子IL-2、TNF-α和GM-CSF。

人骨形成蛋白-2和骨保护素在小鼠成肌细胞中的共表达

目的 构建人骨形成蛋白 - 2 (BMP- 2 )和骨保护素 (OPG)的共表达真核载体 ,研究其在小鼠成肌细胞C2 C12中的表达。 方法 以人骨肉瘤细胞系 MG6 3的总 RNA为模板 ,RT- PCR法获得人 OPG的编码区 c DNA,克隆入真核表达载体 p IRES2 - EGFP的多克隆位点 ,再将人 BMP- 2的编码区 c DNA克隆入 p IRES2 - EGFP中的 Bst X 位点 ,构建 BMP- 2和 OPG的双顺反子真核表达载体 p IRES2 - BMP- 2 - OPG,在阳离子脂质体介导下转染 C2 C12细胞 ,Western blot法检测 BMP- 2和 OPG的表达。 结果 1获得人 OPG编码区全长 c DNA。 2构建人 BMP- 2和 OPG的双顺反子真核表达载体 p IRES2 - BMP- 2 - OPG。 3经 Western blot检测 ,p IRES2 - BMP- 2 - OPG转染 C2 C12细胞后 ,细胞可稳定表达 BMP- 2和 OPG。 结论 构建了人 BMP- 2和 OPG的共表达真核载体 ,并可在 C2 C12细胞中稳定表达 ,为应用 BMP- 2和 OPG进行骨质疏松等疾病的治疗研究奠定了基础。

人骨形成蛋白-2C端102肽的诱骨活性

为分析更短的hBMP 2C端肽是否具有诱骨活性 ,寻求新型的有诱骨活性的基因工程hBMP 2产品。利用温度诱导的大肠杆菌表达系统表达肽段长度为 10 2个氨基酸的hBMP 2C端肽及其Cys的突变体。表达产物经纯化复性后 ,植入小鼠肌袋模型中测试其诱骨活性。获得了能稳定表达hBMP 2C端肽的工程菌 ,测序结果与预期的序列完全一致。表达产物以包涵体形式存在 ,表达量占细胞总蛋白的 3 0 %。产物经纯化复性后 ,小鼠肌袋模型测试结果表明 :hBMP 2 10 2肽仍具有诱骨活性 ,而将C端第一位Cys突变的 10 2肽诱骨活性丧失。实验表明 :比hBMP 2成熟肽 ( 114个氨基酸 )更短的C端 10 2肽仍具有良好诱骨活性 ,这 10 2肽N端第一个Cys对其诱骨活性可能是必需的。

hBMP-3m基因在烟草中的表达

PCR扩增人骨形成蛋白-3成熟肽 hBMP-3m cDNA,纯化后连接入pUC19质粒,构建克隆载体pUC19B3m;用EcoR 和Hind 酶解pUC19B3m和pJIT163,将目的片段插入pJIT163,构建中间载体pJIT163-B3m;再构建植物表达载体pCAMBIA1300-B3m.利用冻融法将质粒pCAMBIA-hBMP3m转入根癌农杆菌 A-grobacteriumtumefaciens LBA4404.以烟草 NicotianatabacumL. 无菌苗叶盘为外植体,通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化,获得了在含25mg/L潮霉素 Hygromycin,Hyg 的筛选培养基上再生的抗性植株,经PCR证实其中部分植株已将人骨形成蛋白-3成熟肽基因整合到烟草基因组中,WesternBlot结果表明已有微量BMP表达.

谷胱甘肽转硫酶-血小板因子4融合蛋白表达载体的构建、鉴定与表达

目的 构建谷胱甘肽转硫酶－血小板因子４ （ＧＳＴ－ＰＦ４）融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法通过ＲＴ－ＰＣＲ方法，从ＨＬ－６０细胞中克隆ＰＦ４ ｃＤＮＡ，然后克隆至载体ｐＵＣ１９中，序列测定后把ＰＦ４基因重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３中，并用ＩＰＴＧ诱导其在大肠杆菌中表达。结果获得了ＰＦ４ ｃＤＮＡ。序列分析表明，该序列与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，ＰＦ４基因已正确插入到ｐＧＥＸ－４Ｔ－３中。重组融合蛋白表达载体ＧＳＴ－ＰＦ４经ＩＰＴＧ诱导表达，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后得到１条蛋白表达带，相对分子质量（Ｍｒ）约为３６ ０００。结论成功地构建融合蛋白表达载体ＧＳＴ－ＰＦ４，并在大肠杆菌中获得有效表达，为进一步研究打下良好的基础。

小鼠4-1BBLcDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 :克隆小鼠 4 1BBL基因 ,构建其真核表达载体 ,并观察其在哺乳动物细胞中的表达 .方法 :取C5 7BL/ 6小鼠脾细胞 ,经PHA诱导后 ,以RT PCR克隆 4 1BBLcDNA ,测序 ,构建 pCDNA3.1 (+) m4 1BBL真核表达质粒 ,转染COS 7细胞 ,RT PCR检测m4 1BBLmRNA表达 ,间接免疫荧光法和流式细胞仪检测 4 1BBL蛋白的表达 .结果 :从小鼠脾细胞中克隆到m4 1BBLcDNA ,经测序完全正确 ,所构建的m4 1BBL质粒在COS 7细胞中获得高效表达 .结论 :小鼠 4 1BBLcDNA基因克隆、真核表达载体构建及其在COS 7中的表达均获成功 。

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建含小鼠 4 - 1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体 ,并检测其在COS - 7细胞中的表达。方法 :将目的基因 4- 1BBL克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2 -EGFP ,构建真核表达载体pIRES2-EGFP -m4 - 1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS - 7细胞 ,以RT -PCR和观察细胞内荧光的方法检测m4 - 1BBL的表达。结果 :酶切鉴定和序列分析证实 ,重组质粒含有人 4 - 1BBL全长cDNA编码序列 ,转染实验表明 4 - 1BBL基因能在COS - 7细胞中表达。结论 :鼠 4 - 1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS - 7中的表达均获成功 ,为进一步研究奠定了基础。