人DNA修复基因hR24L参与细胞周期检定点调控

目的：研究酵母ＲＡＤ２４Ｌ基因功能，克隆人类同源物。方法：分离ＲＡＤ２４基因区域ｒａｄ２４Ｌ突变株，以人的ｃＤＮＡ表达文库转化突变株，筛选回复表型；大剂量Ｘ线照射观察细胞周期。结果：ｒａｄ２４Ｌ对紫外线敏感，从转化文库后的回复表型中克隆出人类ｈＲ２４Ｌ全长ｃＤＮＡ。结论：克隆的人类ＤＮＡ修复基因ｈＲ２４Ｌ，它能校正ｒａｄ２４Ｌ的突变表型，参与细胞周期检定点调控。

酵母DNA修复基因RAD16温度敏感突变株的分离及人类互补基因的鉴定

用PCR介导的基因重组法敲除酵母RAD16基因,用羟胺处理酵母RAD16基因表达质粒,获得RAD16基因突变库,并将其转化RAD16基因敲除的酵母细胞.用平皿复制法获得温度敏感突变株rad16-ts2,经互补试验证实,该突变表型为RAD16基因突变所致.将人cDNA表达文库转化rad16-ts2后筛选温度敏感拯救(rescue)表型,回收拯救表型酵母细胞中的质粒.测序结果表明,所获得的人cDNA克隆为HLTF/Zbu1/SMACA3基因.比较分析显示,人类该基因编码蛋白质氨基酸序列与酵母Rad16的同一性为32%,相似性则达50%.人HLTF/Zbu1/MACA3基因在HeLa细胞中过表达,可显著抑制过氧化氢损伤和UV照射诱导的细胞凋亡.

紫外线照射对DNA修复基因RAD24转录的影响

目的：紫外损伤对ＤＮＡ修复基因ＲＡＤ２４转录的影响。方法：以酿酒酵母ＨＹ６８４为实验对象，用波长２５４ｎｍ紫外线分别在０、３７、５０和７０Ｊ／ｍ２等强度下照射不同时间，提取总ＲＮＡ，应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法检测ＲＡＤ２４基因转录水平的变化。结果：３７Ｊ／ｍ２及５０Ｊ／ｍ２分别照射２０～１２０ｍｉｎ明显提高ＲＡＤ２４基因转录水平。结论：低剂量紫外线照射可提高ＲＡＤ２４基因转录水平，该基因的表达具有损伤诱导性。

啤酒酵母DNA修复基因RAD24温度敏感突变株的分离及其特性的初步研究

以ＹＣｐｌａｃ系列带Ｔｒｐ、Ｈｉｓ和Ｕｒａ标志基因的载体为骨架构建含野生型和经羟胺处理的突变型的啤酒酵母ＲＡＤ２４基因质粒，用质粒替换方法分离ＲＡＤ２４基因温度敏感突变株（ｒａｄ２４－ｔｓ３）．紫外生存试验发现，ｒａｄ２４－ｔｓ３对紫外线敏感；同位素（３Ｈ－ＴｄＲ，３Ｈ－ＵＲ，３Ｈ－Ｌｅｕ）参入试验表明，该突变株ＤＮＡ、ＲＮＡ及蛋白质合成均较野生型明显降低．

DNA修复基因RAD_（24）的分子克隆和序列分析

利用缺口修复（ｇａｐｒｅｐａｉｒ）方法克隆啤酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）野生型ＲＡＤ_（２４）基因，并将其亚克隆到Ｍ１３ｍｐ１８和Ｍ１３ｍｐ１９，用双脱氧末端终止法对该基因的两条链均进行了序列测定。ＤＮＡＳｔｒｉｄｅｒ程序分析显示该基因编码２６８个氨基酸的蛋白质；基因缺失试验表明，该基因为细胞生存所必需。

胆红素的体外酶促合成

利用差速离心、硫酸铵分级沉淀及柱层析技术制备血红素加氧酶和胆绿素还原酶,分别用NADPH和NADH作为辅酶,以血红素为作用物,体外酶促合成胆红素,测得NADPH的Km值为45μmol/L,NADH的Km值为0.9mmol/L。

白细胞介素4与血管活性多肽对大鼠血管平滑肌细胞增殖的调节作用

以＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法观察内皮素（ＥＴ）、血管紧张素Ⅱ及白细胞介素４（ＩＬ－４）单独作用和联合作用时对大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的影响。结果发现ＩＬ－４能抑制培养的自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）的＾３Ｈ－ＴｄＲ的掺入（最低浓度为５ｎｇ／ｍｌ），并存在剂量效应关系，而对正常血压大鼠（ＷＫＹ）的ＶＳＭＣ无影响；但预先以ＥＴ或ＡＧ－Ⅱ刺激ＷＫＹ的ＶＳＭＣ的增殖。

紫外照射对DNA修复基因RAD24转录的影响

以酿酒酵母HY684为实验对象,用波长254nm紫外线分别在0,37,50和70J/m^2等强度下照射不同时间,提取总RNA,应用North-ern杂交方法检测RAD24基因转录水平的变化。结果显示37J/m^2、50J/m^2照射20分钟到120分钟明显提高RAD24基因转录水平,70J/m^2照射时,则恢复至正常水平,这说明低剂量紫外线照射可提高RAD24基因转录水平,该基因的表达具有损伤诱导性。

川芎嗪对缺氧缺糖培养心肌细胞蛋白质、RNA合成及一氧化氮合酶基因表达的影响

目的：观察川芎嗪对心肌细胞缺氧缺糖损伤的保护作用。方法：本实验利用心肌细胞缺氧缺糖损伤模型，采用同位素掺入、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析方法，观察川芎嗪注射液对心肌细胞缺氧缺糖时蛋白质、ＲＮＡ合成及一氧化氮合酶（ＮＯＳ）ｍＲＮＡ表达的影响。结果：川芎嗪注射液可提高培养心肌细胞缺氧缺糖时３Ｈ亮氨酸（Ｌｅｕ）和３Ｈ尿嘧啶核苷（ＵＲ）的掺入率，促进蛋白质、ＲＮＡ合成，诱导ＮＯＳｍＲＮＡ在缺氧缺糖心肌细胞的表达。

精制血府胶囊对缺氧缺糖心肌细胞一氧化氮合酶基因表达的影响

应用血清药理学、反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交等方法比较研究了精制血府胶囊、血府逐瘀胶囊、硫氮酮对缺氧缺糖培养心肌细胞一氧化氮合酶（ＮＯＳ）ｍＲＮＡ表达及乳酸脱氢酶（ＬＤＨ－Ｌ）、肌酸激酶（ＣＫ）、谷草转氨酶（ＧＯＴ）释放的影响。结果表明：三种药物均可显著提高缺氧缺糖心肌细胞ＮＯＳｍＲＮＡ的表达（Ｐ＜０．０１），且以精制血府胶囊最显著（Ｐ＜０．０１）。三种药物均可显著降低缺氧缺糖心肌细胞ＬＤＨ－Ｌ、ＣＫ、ＧＯＴ的释放（ｐ＜０．０１）。精制血府胶囊和硫氮 酮抑制ＬＤＨ－Ｌ的释放较血府逐瘀胶囊更为显著（Ｐ＜０．０１）。提示：三种药物均具有明显的心肌细胞保护作用，以精制血府胶囊和硫氮 酮为优，这种保护作用与其刺激心肌细胞生成一氧化氮（ＮＯ）有一定关系。

血管平滑肌细胞增殖及其代谢活性的测定

本文首先报道培养的新西兰大白兔的血管平滑肌细胞(SMC)能对WST-1进行还原代谢,并联合应用WST-1和BrdU ELISA测定同一标本的SMC的增殖及其代谢活性。结果表明:随着胎牛血清浓度的增加,SMC活细胞数目、WST-1和BrdU的OD值逐渐增多。说明WST-1和同一标本的WST-1和BrdU ELISA联合测定方法是检测SMC增殖的指标,能客观地反映SMC的DNA合成和代谢活性。

氨氯地平抑制氧化型胆固醇诱导的血管内皮细胞凋亡

目的 :研究氧化型胆固醇 (Triol与 2 5 -OH)对人脐静脉内皮细胞凋亡的诱导作用 ,并观察氨氯地平对氧化型胆固醇诱导内皮细胞凋亡的影响。方法 :体外培养人脐静脉内皮细胞 ,利用光镜、电镜、DNA电泳及流式细胞仪测定作为凋亡检测指标。结果 :对照及胆固醇组未检测到细胞凋亡 ,Triol与 2 5 -OH处理组光镜、电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变 ,电泳示“DNAladder” ,流式细胞仪检测出现亚二倍体峰 ,凋亡率分别为 3 2 2 5 %与 2 3 0 4 %,而氨氯地平使其凋亡率分别下降至 13 42 %与 11 77%。结论 :氧化型胆固醇 (Triol与 2 5 -OH)可以诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡 ,而氨氯地平抑制其凋亡诱导作用。

去甲斑蝥素对乳腺癌细胞系MCF-7^(adr)生长与凋亡的影响

目的:探讨去甲斑蝥素(NCTD)对耐阿霉素乳腺癌细胞系MCF-7adr生长及凋亡的影响,为其临床应用提供实验依据。方法:采用MTT法测定NCTD抑制效应;利用光镜及荧光显微镜观察处理后的细胞形态变化;利用流式细胞术检测细胞凋亡;利用细胞免疫化学检测增殖、凋亡相关因子bcl-2、p53的表达。结果:NCTD对乳腺癌细胞MCF-7adr的生长有明显的抑制作用,且呈剂量、时间依赖性。NCTD处理48h后,MCF-7adr细胞内ki-67阳性指数由(96.8±1.3)%下降至(18.8±1.9)%;PCNA蛋白阳性指数由(95.4±1.1)%降至(59.2±1.9)%。NCTD处理48h后,在光镜下可见MCF-7adr细胞出现发泡、皱缩,有些细胞出现碎裂,经Hoechst染色证实NCTD处理后出现典型的凋亡表现。流式细胞术显示NCTD处理48h后,出现亚二倍体峰,随剂量的增加(120、240、360、480μmol/L),凋亡率分别增加11.67%、16.51%、18.29%、20.79%。NCTD处理48h后,MCF-7adr细胞突变型p53蛋白表达率为(97.8±1.64)%,经NCTD240μmol/L处理后表达率下降为(47.2±9.8)%;Bcl-2蛋白表达率由(98.87±3.74)%下降为(17.5±1.64)%。结论:NCTD能抑制MCF-7adr细胞生长、增殖,降低ki-67阳性指数率,促进MCF-7adr细胞凋亡与凋亡相关因子bcl-2及突变型p53蛋白的表达。

DNA损伤与细胞周期调控

Ｄ Ｎ Ａ 损伤和损伤后修复可引起细胞周期阻滞， 这一事件由三个阶段组成： 损伤的识别， 损伤信号的传递以及细胞周期阻滞． 在某些情况，

氧化甾醇诱导血管平滑肌细胞凋亡及其作用特点的研究

目的研究３β，５α，６β－胆甾烷二醇（Ｔｒｉｏｌ）诱导血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）凋亡及其与２５－羟胆固醇（２５－ＯＨ）比较的特点。方法体外培养ＶＳＭＣｓ、光镜、透射电镜及ＴＵＮＥＬ技术。结果ＶＳＭＣｓ经Ｔｒｉｏｌ处理后，贴壁层细胞呈现核染色质浓集，核碎裂和凋亡小体形成等凋亡的超微结构变化；ＴＵＮＥＬ显示ＶＳＭＣｓ凋亡细胞数随Ｔｒｉｏｌ浓度的增加而增多；剂量为 ３０ μｍｏｌ·Ｌ－１的 Ｔｒｉｏｌ和 ２５－ＯＨ诱导 ＶＳＭＣｓ的凋亡作用，前者不能而后者能被 ５０ μｍｏｌ·Ｌ－１的胆固醇所抑制。结论Ｔｒｉｏｌ能诱导ＶＳＭＣｓ凋亡，不同氧化甾醇可能有不同的作用通道和机制；氧化甾醇诱导ＶＳＭＣｓ凋亡可能是引起动脉粥样硬化斑块破溃，导致急性心血管事件发生的机制之一。

电离辐射对人乳腺癌MCF7细胞系hR24L基因表达的影响

目的 :研究电离辐射对人类DNA修复基因hR2 4L表达的影响。方法 :通过RT -PCR从人乳腺癌MCF7细胞总RNA中扩增hR2 4L的开放阅读框 (ORF) ,经测序无突变后用γ射线照射细胞。照射后不同时间收集细胞 ,提取总RNA ,用Northern印迹杂交分析hR2 4L表达变化。结果 :hR2 4L基因的转录在电离辐射后 1h后开始上升 ,2h达高峰 ,3h恢复正常。结论 :该基因的表达具有损伤诱导性特点 ,对γ射线损伤有修复作用。

HeLa细胞中hR24L基因的表达、DNA损伤修复、G_2/M阻滞与电离辐射之间的关系(简报)

DNA是生命活动中最重要的遗传物质,保持其分子结构的完整性对于细胞至关重要,因此研究DNA损伤修复是生命科学的重要课题之一.基因组比较简单,易于操作的单细胞真核生物酵母遂成为研究DNA损伤修复的重要材料.对紫外线或电离辐射敏感的酵母突变株称为rad突变株.酵母细胞的基因组中有近30个遗传位点与辐射抗性有关.根据单突变和双突变的敏感特征所得出的上位关系可将其分为3个上位显性组[1,2]:RAD3组,该组成员参与核苷酸的切除修复,其突变株对紫外线敏感;RAD6组,参与复制后修复,其突变株对化学诱变剂敏感;RAD52组,参与重组修复(包括链断裂修复),其突变株对电离辐射敏感.RAD24基因属于RAD3组,兼有其他组的某些特性.

Ku70和Ku80基因在系统性红斑狼疮患者皮肤上的表达

目的 :研究Ku70和Ku80基因在系统性红斑狼疮 (systemiclupuserythematosus,SLE)患者皮肤表达的变化及其与SLE发病的关系。方法 :利用Ku70、Ku80地高辛标记的cDNAs探针对皮损区、非皮损区及正常对照皮肤进行原位杂交。结果 :Ku70、Ku80mRNAs的表达量从高到低依次为SLE皮损区、SLE非皮损区、正常皮肤。另外还发现在皮肤的层次上真皮浅层单一核细胞Ku70、Ku80mRNAs表达量高于表皮基底层细胞、表皮棘细胞层和颗粒层细胞。结论 :Ku70、Ku80mRNAs的表达在SLE患者皮肤上发病区高于非发病区 ,更大于正常皮肤。Ku70、Ku80mRNAs表达的变化与SLE的发病有关 。

精制血府胶囊对缺氧缺糖心肌细胞ET-1与ECE-1基因表达影响的研究

本研究采用原位杂交技术,探讨精制血府胶囊对与心肌缺血密切相关的基因表达的影响,阐明其抗心肌缺血的分子机制。结果:精制血府胶囊、血府逐瘀胶囊,硫氮革酮等三种“药血清”组的LDH、CK、COT释放量与同浓度的兔血清组比较均有极显著差异(p<0.01)。精制血府胶囊组、硫氮草酮组抑制LDH的释放较血府逐瘀胶囊组显著(p<0.01)。原位杂交显示:ET-1的基因杂交结果,精制血府胶囊组与正常培养细胞组均未见杂交颗粒,硫氮草酮组与缺氧缺糖组心肌细胞核周围胞质中可见大量杂交颗粒;血府逐瘀胶囊组,兔血清组仅见少量杂交颗粒。ECE-1的基因杂交结果,缺氧缺糖组,兔血清组与硫氮草酮组心肌细胞胞质中均可见大量杂交颗粒,且三组无明显差异;精制血府胶囊组、血府逐瘀胶囊组、正常培养组均未见阳性杂交信号。结果表明,精制血府胶囊具有心肌细胞保护作用,并与其抑制ET-1,ECE-1的基因表达有关。