布鲁氏菌BspF蛋白生物信息学分析及其对巨噬细胞炎症因子表达的影响

【目的】对布鲁氏菌BspF蛋白进行生物信息学分析,并进一步探究BspF蛋白对巨噬细胞炎症因子表达的影响。【方法】利用生物信息学在线软件分析布鲁氏菌BspF蛋白的理化性质、亲/疏水性、信号肽、跨膜区、抗原决定簇及结构域、二级结构、三级结构。构建重组质粒pET-32a-BspF并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达BspF蛋白并进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting检测蛋白表达及纯化情况。通过CCK-8法检测纯化后BspF蛋白对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的毒性,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测BspF蛋白对细胞中炎症相关因子mRNA和蛋白表达的影响。【结果】BspF蛋白分子质量为48.75 ku,属于不稳定蛋白,具有15个抗原决定簇,不存在跨膜区域和信号肽,二级结构以α-螺旋为主。成功构建了布鲁氏菌BspF基因原核表达载体,诱导表达后获得大小为60 ku的目标蛋白。纯化后蛋白以50μg/mL终浓度刺激RAW264.7细胞24 h后,与对照组相比,BspF组细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA表达量均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),NLRP3、Pro-Caspase-1蛋白表达量均极显著升高(P<0.01)。【结论】布鲁氏菌BspF蛋白能通过NLRP3炎症小体触发宿主细胞炎症反应,促进巨噬细胞炎症因子的表达。结果为布鲁氏菌致炎机制的研究和抗炎靶点的筛选提供理论基础。

高速列车轴承可靠性试验时间的确定及可靠性寿命评估

受产品成本和试验时间的限制,高速列车轴承可靠性试验一般采用小样本、定时截尾试验方案。在此情况下,如何确定出可靠性试验时间和对轴承的可靠性寿命进行分析是值得深入研究的问题。从轴承疲劳寿命服从的分布入手,推导出高速列车轴承样本数和试验时间的数学模型,采用Bayes多层估计法对无失效试验数据进行了处理,建立起高速列车轴承的可靠性寿命评估模型,并以国产高速列车轴承为例给出仿真计算结果。

高速磨削电主轴可靠性加速寿命试验分析

为在短时间内获得高速磨削电主轴的寿命信息,通过加大载荷应力的方式建立起加速寿命试验模型,进行了两组恒定应力加速寿命试验。采用威布尔分布对电主轴寿命进行描述,并借助于最小二乘法对威布尔分布函数的两个参数进行估算,确定出电主轴可靠性寿命的相关指标,最终计算出基准载荷下电主轴的可靠性寿命。数据统计结果表明,电主轴的寿命服从威布尔分布,其加速模型符合逆幂律关系,从而验证了在不改变失效机理的前提下对高速磨削电主轴进行载荷应力加速寿命试验的可行性,极大地提高了产品寿命的预测效率,对电主轴生产厂商和用户均有很强的指导意义。

基于改进的模糊层次分析法的电主轴可靠性分配

根据数控机床用高速电主轴系统的可靠性分配指标具有多层次、多因素且定量与定性指标并存的特点,采用改进的模糊层次分析法,以150MD36Q11磨削电主轴为例,从影响可靠性分配的众多不确定因素出发,建立可靠性分配的层次分析结构,定量分析计算出组成电主轴系统的主轴、轴承、电机等各组件的权重,根据权重完成对电主轴系统可靠性的合理分配。所得结果与电主轴实际运行情况基本吻合,证明该方法具有较好的实用性,较传统层次分析法更科学、合理且更简单易行,能够为电主轴的设计提供一定的依据。

极小样本下高速列车轴承的可靠性评估

针对高速列车轴承在极小样本零失效情况下的可靠性试验评估问题,采用Bayes数据统计理论将先验信息与试验信息进行融合,建立累积失效概率数学模型,根据最小二乘法求解出二参数威布尔分布中的待定参数,得出高速列车轴承可靠性数学模型。研究结果为评估高速列车轴承的可靠性和运行安全性提供了一定的理论依据。

随机性能退化下极小样本高速列车轴承的可靠性评估

针对高速列车轴承性能退化过程缓慢、退化轨迹较为平稳的特点,本文采用随机性能退化过程建模,将Wiener过程的未知参数看作随机变量,根据轴承相对温度性能退化幅度的大小以及工程经验确定出合理的退化轨迹模型,最终得出轴承寿命的可靠度函数。通过对某型号轴承试验数据的实例分析,表明文中的方法能够在极小样本无失效数据情况下充分利用性能退化数据,完成产品寿命的可靠性评估。

混合Beta分布下高速列车轴承的可靠性寿命评估

由于高速列车轴承造价昂贵、精度和可靠性要求极高等问题,在进行可靠性寿命试验时,只能做极小样本、短时间内的定时截尾寿命试验。为有效的对其进行可靠性评估,采用不完全混合Beta分布作为轴承累积失效概率的先验分布,结合多层Bayes可靠性评估方法,求解出极小样本无失效情况下的高速列车轴承可靠性数学模型。通过计算,在给定的可靠性指标要求下,所得结论符合实际情况,且采用不完全混合Beta分布作为先验信息的评估方法较传统Bayes方法具有明显的合理性。

高速列车轴承的可靠性试验标准和规范研究

为了研究高速列车轴承的可靠性,国际铁路联合会和其他组织先后颁布了相应的铁路轴承试验标准和规范,而我国高速列车轴承的发展相对落后,同时也缺少铁路轴承方面的试验标准和规范。针对这一问题,在分析国内轴承可靠性试验标准和规范的基础上,参考国外铁路轴承试验规范和标准,通过对比分析,对我国高速列车轴承的可靠性试验标准和规范提出了建议。

布鲁氏菌BPE159基因缺失株的构建及BPE159蛋白对细胞自噬因子表达的影响

【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同时间点的生存繁殖能力。【结果】成功构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159和回补株S2308ΔBPE159-C,并可稳定遗传10代。实时荧光定量PCR结果显示,经布鲁氏菌侵染24 h后,与PBS组相比,S2308组中自噬因子ATG5基因表达水平显著降低(P<0.05),Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平极显著降低(P<0.01);与S2308组相比,S2308ΔBPE159组自噬因子Beclin1、LC3a基因表达水平显著升高(P<0.05),ATG5、LC3b基因表达水平极显著升高(P<0.01)。生长曲线结果显示,在相同培养条件下,S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株与S2308株具有相似的生长变化趋势。胞内生存试验结果显示,侵染8 h后,S2308ΔBPE159株在细胞中的数量极显著低于亲本株S2308(P<0.01),12和24 h存活能力显著低于S2308株(P<0.05)。【结论】本研究成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌BPE159基因缺失株和回补株,S2308ΔBPE159株与S2308株生长趋势相似,但生存繁殖能力明显下降;BPE159基因缺失后布鲁氏菌可促进细胞自噬因子的表达,本研究结果为研究布鲁氏菌分泌蛋白的生物学功能和调控机制奠定了基础。

北美引进大麦种质资源农艺性状分析

对北美引进的300份大麦种质进行农艺性状考察与评价,结果表明,种质资源之间各个性状变异丰富。大部分材料株高为半矮秆或中间型,穗长中等偏短,穗粒数多,千粒重较高,大粒资源丰富。从中筛选出一些综合性状较好的和一些单一性状优良的材料。相关分析表明,株高与穗长、全生育期,穗长与穗粒数、千粒重、全生育期,穗粒数与千粒重、全生育期、小区产量,千粒重与全生育期之间的相关关系显著。

产学研模式下工科专业实践教学体系与机制建设研究

本文在产学研模式下探索工科专业实践教学体系建设的规律,尝试破解当前困扰高校工科专业开展实践教学投入不足、缺乏实践师资等瓶颈问题。在校企合作的科研平台下,拓展建设校外实践教学基地,引入企业技术人员来校开展联合实践教学工作;同时,在高校科研服务企业的过程中,提高教师工程能力,实现教研相长,真正实现科研反哺教学。

随机时滞种群系统解的吸引性和有界性

研究了与年龄相关的随机时滞种群系统模型,运用Lyapunov第二方法和It公式,得到了随机时滞种群系统方程吸引性和有界性的一些结论,给出了保证强解吸引和有界的充分条件.

PEDV感染过程中TRIM5α介导的自噬对病毒复制的影响

旨在研究三结构域蛋白5α(tripartite motif protein 5α,TRIM5α)能否通过调控细胞自噬来影响猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viru,PEDV)在非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)中的复制。利用Western blot(WB)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达,明确PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TRIM5α在自噬模型中的表达水平。设计并合成3条TRIM5α的干扰片段并筛选干扰效率最高的干扰片段,将其转染至Vero-E6细胞,PEDV感染后48 h,通过WB检测LC3Ⅱ蛋白的表达水平;RT-qPCR检测PEDV的N、ORF3基因的表达水平,同时检测PEDV滴度变化,以明确TRIM5α对自噬和PEDV复制的影响。结果表明:PEDV成功感染Vero-E6细胞并诱导细胞自噬。WB结果显示感染24、36和48 h时,试验组的LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势,在48 h时表达量最高,且差异极显著(P<0.01),自噬被激活;RT-qPCR结果显示,TRIM5α的表达呈现上升趋势,在感染48 h时表达量最高,且差异极显著(P<0.01)。siRNA-2的干扰效果最好。干扰TRIM5α后,WB结果显示LC3Ⅱ蛋白表达量降低,自噬受到抑制,且RT-qPCR结果显示PEDV为N、ORF3基因的表达水平显著升高,病毒滴度明显上升。研究表明,TRIM5α通过促进细胞自噬抑制PEDV在Vero-E6细胞中的复制。

布鲁氏菌BAB-RS25305蛋白对细胞炎症因子表达的影响

旨在对布鲁氏菌BAB-RS25305基因进行原核表达以及纯化,并探究其对细胞炎症细胞因子表达的影响。根据GenBank中所提供的BAB-RS25305基因序列(登录号:NC-007618.1)设计1对特异性引物,通过PCR扩增出BAB-RS25305基因片段并连接至PMD19-T载体,将构建好的PMD19-T-BAB-RS25305重组质粒转化至E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切后将产物连接至pET-32a载体,然后转入E.coli BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达并且纯化重组蛋白BAB-RS25305,将纯化后的蛋白以终浓度为50μL/mL刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,Real-time PCR和Western blot检测炎症相关因子NLRP3、caspase-1的表达变化。结果显示,成功构建了布鲁氏菌BAB-RS25305表达载体,经IPTG诱导表达后在32 ku左右出现一条特异性条带,与预期大小一致。用BAB-RS25305重组蛋白刺激小鼠巨噬细胞24 h后,发现与PBS对照组相比,BAB-RS25305重组蛋白试验组能够显著提高NLRP3以及caspase-1的表达。说明布鲁氏菌BAB-RS25305基因能够触发宿主细胞发生炎症反应,为揭示布鲁氏菌的胞内生存以及致病机理提供了理论依据。

思山岭铁矿地下选矿厂工艺设计

思山岭铁矿属大型地下开采矿山,采用地表选矿厂对矿石进行处理时井下提升和地表运输成本高。为降低企业生产成本,考虑将选矿厂直接建到地下深部,不但可以减少地表选矿厂占地,降低对地表环境的影响,还可以降低生产成本。根据思山岭铁矿矿石性质,由条件试验确定采用湿式磁选抛尾、阶段磨矿阶段磁选工艺。对半自磨工艺与高压辊磨工艺的投资、生产经营费用等比较后,确定采用粗碎—半自磨细碎—湿式磁选抛尾—阶段磨矿—阶段弱磁选工艺,该工艺具有流程简单、硐室数量少、井下基建工程量小、基建周期短、井下运输及通风系统相对简单等特点。

钟山铁矿选矿工艺研究

采用高压辊磨—粗粒湿式磁选抛尾—阶段磨矿、阶段弱磁工艺流程对钟山磁铁矿进行了选别试验。结果表明,高压辊磨产品(-3 mm)经湿式预选后可提前抛出产率50.05%、全铁品位8.33%的尾矿,入磨矿石铁品位由23.67%提高到39.18%,为降低企业生产成本提供了技术支撑;预选精矿经阶段磨矿、阶段弱磁选可获得铁品位65.13%、铁回收率61.48%、磁性铁回收率98.65%的最终铁精矿产品。

婺源茶商俞仰清兴发史略

婺源茶商俞仰清兴发史略江西省婺源县思口镇人民政府朱德馨婺源历史上曾有“士农之家五，商之家三，工之家一”的记载，可谓婺俗多商。婺源产茶历史悠久，茶叶孕育了不少商贾，而近代婺人尤以茶商俞仰清因深得经营之道而显赫一时，在婺商中独领风骚，影响极为深远。俞仰清...

布鲁氏菌分泌蛋白BMCO基因缺失株的构建及生物学特性研究

【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1800 V电压、400Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】试验成功获得片段大小为522、539、1054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。

长链非编码RNA在PEDV感染Vero-E6细胞中对自噬的调控作用

【目的】试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru,PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用,以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】根据GenBank上公布的人lncRNA-HOTAIR基因序列(登录号:NR_047517.1),利用LongMan在线工具筛选lncRNA-HOTAIR的猴源同源序列(lncRNA-M),并利用RNAfold、LncLocator在线预测工具预测其二级结构和核质分布。建立PEDV感染的Vero-E6细胞模型,在0、6、12、24、36和48 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测微管相关蛋白1-轻链3(LC3)蛋白的表达,以明确病毒感染细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-M在PEDV感染Vero-E6细胞模型中0、6、12、24、36和48 h的表达水平。设计并合成3条lncRNA-M的干扰片段:siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3,分别转染Vero-E6细胞,待细胞汇合度达到90%时接毒,感染48 h后利用实时荧光定量PCR检测lncRNA-M的表达情况,筛选出干扰效率最高的干扰片段。将干扰效率最高的干扰片段转染至Vero-E6细胞并接种PEDV后,通过Western blotting检测感染后24和48 h LC3蛋白的表达水平,以验证自噬的发生情况。【结果】成功筛选出lncRNA-HOTAIR猴源同源序列为lncRNA 0.1,并根据RNAfold预测结果生成lncRNA 0.1的RNA最小自由能二级结构;LncLocator预测结果表明,lncRNA 0.1在细胞核和细胞质中的分布分别为41.88%和37.78%。PEDV感染Vero-E6细胞48 h后,细胞皱缩、聚集成团,细胞膜融合形成合胞体;1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示,在1326 bp处出现目的条带,说明PEDV感染Vero-E6细胞模型成功建立。在PEDV感染的Vero-E6细胞模型中,Western blotting结果显示,6、12、24、36和48 h LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在48 h最高且极显著高于0 h(P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示,LC3的mRNA表达量在48 h最高,且极显著高于0 h(P<0.01),自噬被激活;lncRNA 0.1的表达均呈上升趋势,在48 h表达量最高,48 h lncRNA 0.1的表达量极显著高于0 h(P<0.01);siRNA-2的干扰效果最好,干扰效率为80%。干扰lncRNA 0.1后,Western blotting结果显示,24和48 h干扰组的LC3蛋白表达量均低于对照组,自噬受到抑制。【结论】PEDV感染Vero-E6细胞能够诱导自噬发生,lncRNA 0.1在感染过程中起到了促进自噬的作用。

TGF-β1在布鲁氏菌致炎过程中的作用及其与NLRP3炎症小体的相关性研究

建立牛布鲁氏菌2308感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,用RT-qPCR检测感染细胞中TGF-β1在mRNA水平的变化;ELISA检测布鲁氏菌感染细胞后培养上清中TGF-β1、IL-1β和IL-18的释放量;Western blot分析TGF-β1蛋白水平的变化。布鲁氏菌侵染重组外源TGF-β1(rTGF-β1)预孵育的巨噬细胞,检测TGF-β1对炎症因子IL-1β和IL-18的影响。构建布鲁氏菌感染小鼠模型,建模28 d后,将TGF-β1抗体以浓度为1μg/mL的剂量尾根静脉注射感染小鼠,分别在注射TGF-β1后第1天、第15天、第30天收集小鼠外周血,ELISA检测小鼠外周血血清中炎性因子IL-18和IL-1β分泌量。与对照组相比,在细菌侵染细胞前期TGF-β1在转录水平表达上调,而在进入细胞后表达下调,细胞上清中TGF-β1的含量显著升高(P<0.05),且在蛋白水平也出现差异性高表达。预孵育rTGF-β1后布鲁氏菌侵染的巨噬细胞中炎症因子IL-1β和IL-18释放量显著升高(P<0.05)。布鲁氏菌感染小鼠1周~4周后感染组小鼠血清中炎性因子TGF-β1的分泌量显著性低于对照组(P<0.05),在感染第2周后逐步上升。布鲁氏菌感染小鼠后各脏器有明显的病理变化,免疫组化结果显示TGF-β1在脾脏和肝脏中均有不同程度的表达。TGF-β1抗体的注射能够显著性降低布鲁氏菌感染鼠血清中IL-1β和IL-18的分泌(P<0.05),布鲁氏菌感染过程中细胞因子TGF-β1分泌增加,外源性TGF-β1显著增加炎性IL-1β和IL-18的产生,而TGF-β1抗体注射布鲁氏菌感染小鼠可以缓解炎症反应。