5-磷酸核糖醇转移酶fukutin抑制HeLa细胞中α-dystroglycan的分泌

目的探究5-磷酸核糖醇转移酶fukutin(FKTN)对HeLa细胞周期、凋亡、迁移以及α抗肌萎缩相关糖蛋白(α-DG)分泌的影响。方法构建质粒pcDNA3.1-α-DAG-HA,将pcDNA3.1-FKTN-3xFlag转染至HeLa细胞,提取总蛋白,Western blot法检测FKTN的过表达;过表达FKTN后利用流式细胞术检测细胞周期、凋亡情况;过表达FKTN后,采用细胞划痕实验检测细胞迁移速率,使用麦胚凝集素琼脂糖珠(WGA-agarose)富集培养液中的α-DG,然后进行Western blot检测。结果成功构建pcDNA3.1-α-DAG-HA真核表达质粒;FKTN在HeLa细胞中可过表达;过表达FKTN后与对照组相比,实验组细胞周期S期百分比下降(P<0.001),细胞凋亡率无变化(P>0.05);过表达FKTN后与对照组相比,实验组细胞迁移速率无变化(P>0.05),α-DG分泌量减少。结论过表达FKTN阻滞HeLa细胞周期,抑制α-DG分泌,但对细胞凋亡、迁移无影响。

RACK1与CLIC1的相互作用鉴定

目的探究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)与活化蛋白激酶C受体1(RACK1)在细胞内的相互作用。方法构建重组质粒pcDNA3.1-RACK1-HA,转染质粒pcDNA3.1-RACK1-HA和(或)pcDNA3.1-CLIC1-FLAG到HEK 293T细胞中,转染pcDNA3.1-RACK1-HA和(或)pcDNA3.1-CLIC1-FLAG到COS7中。GST-pulldown和免疫共沉淀实验确定CLIC1和RACK1在体内及体外的相互作用。间接免疫荧光实验检测RACK1与CLIC1在细胞中的定位。结果成功构建pcDNA3.1-RACK1-HA,Western blot检测结果证明了RACK1和CLIC1可在HEK 293T细胞中表达,GST-pulldown结果显示RACK1与CLIC1在体外可直接结合,免疫共沉淀结果显示RACK1和CLIC1可在细胞内结合。间接免疫荧光实验表明RACK1与CLIC1可共定位于细胞质。结论RACK1与CLIC1可在细胞中结合。