柔红霉素产生菌阻断突变株的筛选和鉴别

经NTG和紫外光诱变,从天蓝淡红链霉菌正定变种SIPI 1482中获得了阻断突变株N-18和U-25,通过TLC和HPLC分析,证明这两突变株的主要产物均为ε—紫红霉酮,这表明它们都在生物合成途径的中间步骤被阻断。

质粒pIJ702转化天蓝淡红链霉菌SIPI1482菌种的条件研究

天蓝淡红链霉菌ＳＩＰＩ１４８２是一株蒽环类抗生素柔红霉素的产生菌。在建立该菌种基因工程研究所需的载体宿主系统的研究中，发现从变青链霉菌分离的质粒ｐＩＪ７０２不能直接转化ＳＩＰＩ１４８２菌种。经排除ＳＩＰＩ１４８２菌种自身内含质粒，试验了热休克衰减ＤＮＡ酶活性、不同时间培养的菌丝体制备的原生质体、ＰＥＧ１０００的浓度以及硫涟丝菌素选择时间等因素对ｐＩＪ７０２转化ＳＩＨＩ１４８２菌种的影响，证实上述绪因素都不是决定是ｐＩＪ７０２转化ＳＩＰＩ１４８２菌种成败的主要原因。采用ＳＩＰＩ１４８２菌种的阻断突变株Ｎ－１８为中介宿主菌，最终获得了质粒ｐＩＪ７０２转化ＳＩＰＩ１４８２菌种的成功。从Ｎ－１８转化子分离的质粒ｐＩＪ７０２再转化Ｎ－１８和亲株ＳＩＰＩ１４８２，观察到转化频率的大幅度提高，这些结果表明ＳＩＰＩ菌株具有限制一修饰系统，采用突变株为中介宿主可能是克服质粒转化限制性障碍的一个有效方法。

天蓝淡红链霉菌SIPI1482菌株graORF1同源基因的克隆

将含有ａｃｔⅢ基因的质粒ｐＩＪ２３４６及其带有ｇｒａＯＲＦ１～４质粒ｐＩＪ５２０５～５２０８作探针与天蓝淡红链霉菌ＳＩＰＩ１４８２菌种的染色体ＤＮＡ杂交。ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ显示ｐＩＪ２３４６能与２．１ｋｂ的ＢａｍＨⅠ片段杂交；ｇｒａＯＲＦ１能与约６．０ｋｂ和约１０ｋｂＢａｍＨⅠ以及约２０ｋｂＢｃｌⅠ片段杂交。除２．１ｋｂＢａｍＨⅠ片段外，其余的同源片段克隆到质粒ｐＵＣ１８形成几个克隆子，并经ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ确认这些同源片段的存在。含有约１０ｋｂ同源ＤＮＡ片段的ｐＹＧ２５，当转化加利利链霉茵３１６１７时，发现能大大地促进该菌株色素的分泌，表明约１０ｋｂＢａｍＨⅠ同源片段含有某种调节基因。当将质粒ｐＹＧ１１的约６ｋｂＢａｍＨⅠ同源片段克隆到ｐＩＪ６８０构成杂合质粒ｐＹＧ２６并导入变青链霉菌ＴＫ６４，发现同源基因的导入能引起变青链霉菌ＴＫ６４表型的显著变化，表明约６ｋｂ同源基因编码了某些与分化有关的基因。

右旋糖酐蔗糖酶工程菌株的构建及其培养条件的研究

【目的】右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为底物,催化转移D-葡萄糖基生成α-葡聚糖或低聚糖的葡萄糖基转移酶。【方法】利用PCR扩增技术,将已获得的右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG亚克隆到表达载体PET28a(+)上,转化E.coli BL21(DE3),经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后,得到右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG。【结果】经IPTG诱导该基因在E.coli BL21(DE3)中能有效表达,在诱导过程中菌体生长受到抑制。通过对培养时间、IPTG浓度、培养温度、菌浓(OD600)和pH值等产酶因素的优化考察,得到最佳培养条件为:培养时间5h、IPTG浓度0.5mmol/L、25℃、OD600值1.0和pH6.0。酶活力由最初的5.39U/mL提高到35.62U/mL,其中pH值对产酶活力影响最大,在pH6.0时的最高产酶活力是LB原始pH条件下最高酶活的3.5倍,并且pH值也是导致在诱导后期酶活迅速下降的主要原因之一。【结论】酶的表达和酶活的研究结果表明,构建的工程菌株能够异源高效表达右旋糖酐蔗糖酶,并且表现出较高的酶活力。

产黄青霉原生质体制备和再生影响因子分析

产黄青霉原生质体制备过程中 ,菌丝体最佳酶解条件与原生质体释放最适条件不同 ,菌丝体培养基含有 0 .0 5 % L-天冬酰胺时 ,选取培养 48h的菌丝体 ,在裂解酶 (L ysing enzym e)浓度 15 mg/ ml,0 .7mol/ LKCl作为渗透压稳定剂的条件下酶解 ,可获得大量原生质体 ;同时 ,再生培养基中含有 2 5 mm ol/ L Ca2 +离子、上层琼脂浓度 1.1% 。

重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶的纯化及其性质

【目的】研究工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-dexYG产右旋糖酐蔗糖酶的纯化和酶学性质。【方法】工程菌经过IPTG诱导后生产含His-tag融合蛋白的右旋糖酐蔗糖酶,通过硫酸铵沉淀、Ni-NTA亲和层析纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对纯酶进行了酶学性质及动力学研究。【结果】经过SDS-PAGE测得该酶的分子量约为170kDa,与理论推测值基本相同。以蔗糖为底物,酶促反应的最适温度为25～30℃,最适pH值为5.4,动力学常数Km值为10.43mmol/L;酶活在pH5.0～8.0较为稳定,在室温(25℃)保藏4天仍有59%的酶活力,4℃保存7周酶活力仅下降一半,但在35℃以上失活很快;Ca2+对催化作用有较大的促进,Mg2+有微弱的促进作用,K+对催化反应无影响,Cu2+的抑制作用最强。其他试剂对重组酶的活性有不同程度的影响,其中SDS抑制作用很强。【结论】研究为重组右旋糖酐蔗糖酶纯酶的获取、得到稳定性好、活性高的酶反应体系及利用该酶进行催化反应和工业化应用提供了重要参数。

秀丽隐杆线虫-耐药铜绿假单胞菌感染模型的建立

目的建立耐药铜绿假单胞菌感染的秀丽隐杆线虫感染模型。方法利用临床分离的P.aeruginosa A258制备BHI、PGS、NG和Agar线虫感染平板。采用不同浓度的四环素、利福平和多粘菌素B对感染线虫进行治疗,考察感染线虫的存活率。结果不同感染平板对线虫致死情况不同。采用NG感染平板对glp-4;sek-1线虫进行感染,其LT50为3.5d。32μg/mL利福平和16μg/mL多粘菌素B对该感染线虫进行治疗,与不加入药物的对照组相比,其存活率分别提高了5和14倍。但一定浓度的四环素没有提高感染线虫的存活率,在线虫体内不能抑制P.aeruginosa A258的感染,与体外抑菌实验结果相一致。结论建立了秀丽隐杆线虫-耐药铜绿假单胞菌A258感染模型,为此模型用于抗感染化合物的筛选奠定基础。

丝状真菌顶头孢霉染色体DNA的提取

目的探索提取头孢菌素C产生菌顶头孢霉基因组DNA的方法。方法采用氯化苄法、液氮研磨法和酶裂解法。结果较其他两种方法比 ,氯化苄法提取效果好。当提取液pH值为 9 0～10 0、EDTA浓度为 12 0mmol·L-1时 ,所得的顶头孢霉染色体DNA的质量和数量均较理想 ,每克(湿重 )顶头孢霉菌丝体能得到 96 μg的染色体DNA。常规琼脂糖凝胶电泳分析 ,其DNA片断大于2 3kb。结论该分离方法获得的染色体DNA质量较高 。

利用根瘤农杆菌LBA4404 Ti质粒介导高效转化产黄青霉及克隆vgb基因

通过根瘤农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) L BA4 4 0 4中 Ti-质粒的介导将含有透明颤菌血红蛋白 (Vitreoscilla Hemoglobin,VHb)基因 vgb和博来霉素 (bleomycin)抗性基因转移到产黄青霉 (Penicilliumchrysogenum)中 ;利用根瘤农杆菌介导转化产黄青霉孢子时需要有乙酰丁香酮诱导 ;转化菌丝体时乙酰丁香酮不是必要的 ,但一定浓度的乙酰丁香酮可提高转化率 ,与原生质体转化法相比可提高转化率 10倍左右。

离子注入诱变育种技术在柔红霉素高产菌选育中的应用

应用低能 N+ 离子对柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌 SIPI 1482野生型菌株的孢子进行注入诱变选育 ,获得了柔红霉素产抗能力提高 15倍的高产突变株。与亲株的菌落形态比较发现 ,高产突变株 SIPI 1482

顶头孢霉菌原生质体制备及再生条件的改进

对头孢菌素Ｃ的工业生产菌顶头孢霉菌的原生质体制备、储存和再生的具体条件（如破壁酶、菌丝处理、菌龄、再生培养基、原生质体储存液等）进行了研究，优化各种条件后制备的原生质体的再生率最高可达６０％以上，这些改进了的条件也可供其它丝状真菌的原生质体制备和再生借鉴。

基于秀丽隐杆线虫耐药菌感染模型筛选活性化合物

目的建立秀丽隐杆线虫—甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌感染模型,筛选抗耐药菌感染的活性化合物。方法利用耐药菌对线虫进行感染,建立液体条件感染和抗生素救治模型,通过观察感染线虫的存活情况,考察筛选样品活性。结果对456个样品进行考察,发现化合物sipi8294在浓度为16μg/mL时,可以使感染线虫存活率达到60%左右。通过联合用药实验发现,8μg/mL sipi8294和8μg/mL氨苄西林联用,可以使线虫存活率提高到80%以上(vs.8μg/mL氨苄西林组,P<0.01)。sipi829 4与青霉素类药物联用,具有明显的增效作用。结论该模型能反映病原菌在线虫体内的耐药性,并可以用于化合物的筛选,发现具有抗感染或是辅助抗感染作用的化合物。

透明颤菌血红蛋白基因在链霉菌中的克隆和表达

以质粒ｐＩＪ７０２和ｐＩＪ６９９为载体，构建了两个带有透明颤菌（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌａ）血红蛋白（ＶＨｂ）基因（Ｖｇｂ）的大肠杆菌－链霉菌穿梭质粒并转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１、变青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ６４及蒽环类抗生素阿柔比星（阿克拉菌素）产生菌——加利利链霉菌（Ｓ．ｇａｌｉｌａｅｕｓ）ＡＴＣＣ３１１３３，经ＣＯ结合差光谱法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳分析表明Ｖｇｂ在大肠杆菌和链霉菌中得到表达。通过改变培养条件研究溶氧对Ｖｇｂ表达的影响，结果表明在低溶氧的情况下，ＶＨｂ表达量增加。同时发现，在低氧浓度时，ＶＨｂ的表达有利于链霉菌菌体的生长，其菌体生长量高于同样条件下的对照菌株（Ｖｇｂ－）１７％～２９％。

利用秀丽隐杆线虫初步评价药物急性毒性

目的考察秀丽隐杆线虫(C.elegans)是否适合作为一个快速初步评价药物急性毒性的模型。方法采用秀丽隐杆线虫野生型N2和突变型glp-4;sek-1线虫对药物毒性进行评估,通过监测在相同染毒体系中的死亡率,判断2种线虫对药物毒性的敏感度。对4大类抗感染抗生素和3种抗肿瘤药物的毒性进行评估。测定染毒72 h后不同药物的LC50值。结果红霉素对N2和glp-4;sek-1线虫的LC50(72 h)分别为250和120 mg.L-1;阿奇霉素对N2和glp-4;sek-1线虫的LC50(72 h)分别为411和286 mg.L-1,glp-4;sek-1线虫国较N2线虫对药物毒性更敏感,因此,采用glp-4;sek-1线虫作为药物评价体系。本实验中,大环内酯类药物LC50(72 h)为100～300 mg.L-1、四环素类为300～400 mg.L-1、氨基糖苷类药物为400～2500 mg.L-1、青霉素类大于2000 mg.L-1和抗肿瘤药物为40～60 mg.L-1。线虫与小鼠相比,对药物毒性更敏感,并且大部分药物在线虫评价体系中呈现的毒性大小,与小鼠评价体系相类似,即两种评价系统具有较好的正相关性。结论秀丽隐杆线虫合适用于药物急性毒性的初步评价,能够简便快速地判断药物毒性范围。

柔红霉素产生菌Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482中dnmV基因的克隆及阻断

从柔红霉素产生菌SIPI-1482菌株基因组DNA中PCR扩增得dnmV及其上游dnmU基因片段。利用同源重组对SIPI-1482菌株的dnmV基因进行基因阻断,得到一株遗传稳定的破坏子。验证了在该菌株中进行同源重组所需交换臂长度。

酶定向进化的研究策略

定点突变是酶工程中研究酶的结构与功能的常规手段,并广泛用于改变酶的性能。酶的体外定向进化是改造生物催化剂的一种有效的新策略,主要是模拟自然进化进程,通过容错PCR等技术对编码酶的基因进行随机突变,再由DNA改组、交错延伸过程、随机引导重组、递增截短技术等进行突变基因的体外重组,最终经筛选获得所需的酶。本文综述了酶定向进化的研究与应用。

带TrpC启动子的质粒pYG715/Vgb对顶头孢霉的转化

分别以来自于构巢曲霉和酿酒酵母的启动子ＴｒｐＣ和ＴＥＦ１来构建质粒ｐＹＧ７１５／ＴｒｐＣ和ｐＺＲ３３３并转化头孢菌素Ｃ工业生产菌种顶头孢霉，结果发现只有ｐＹＧ７１５／ＴｒｐＣ产生转化子。

TEM-1型β-内酰胺酶基因的克隆、表达及酶的纯化

开发专一性β-内酰胺酶抑制剂,对解决细菌耐药性问题具有重要意义。这项研究需要用到纯度较高的β-内酰胺酶。我们将TEM-1型β-内酰胺酶基因克隆到一个高表达载体中,研究了该酶在大肠杆菌中的高表达条件及分离纯化方法,最终获得的酶纯度大于90％。

链霉素抗性筛选法在柔红霉素产生菌S.coeruleorubidus var.zhengding SIPI 1482菌种选育中的应用

采用链霉素抗性筛选法 ,用含链霉素的高氏一号合成培养基筛选天蓝淡红链霉菌 SIPI 1482菌株对链霉素的抗性自发突变株 ,检测突变株产抗生素水平。实验结果发现 ,在 SIPI 1482菌株的链霉素抗性自发突变株中 ,正向突变的频率比较高 (34% ) ,同时获得了产抗生素能力是原菌株的 1.

柔红霉素产生菌SIPI-1482中dnmV基因功能的阻断及恢复

dnmV基因产物为柔红霉素生物合成途径中TDP-15-脱氧已糖C4酮基还原酶,破坏该基因能阻断柔红糖胺的合成,进而阻断柔红霉素的产生。从天蓝淡红链霉菌(S．coeruleorubidus)SIPI- 1482基因组DNA中经PCR扩增出dnmV及其上游dnmU基因片段,并由此构建了用于阻断dnmV基因的同源重组质粒pYG817,转化SIPI-1482菌株后成功地破坏了dnmV基因,发酵结果显示阻断突变株不再代谢产生柔红霉素,为引入新的基因来改变代谢产物的糖基结构打下了基础。通过导入dnmV基因表达质粒可重建该突变株的生物合成途径,恢复产生柔红霉素,但产量比出发菌株要低。