C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因的克隆及序列分析

【目的】克隆C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因cDNA序列,并进行序列测定和分析。【方法】参照GENBANK公布的C57BL/6小鼠ZFP580 cDNA序列(注册号为AK005257),根据ZFP580 C端编码基因cDNA序列设计1对引物,采用RT-PCR技术,从C57BL/6小鼠的肾脏组织中扩增ZFP580 C端编码基因cDNA序列,回收纯化后与T载体连接,构建重组子pMD18-T-ZFP580,转化大肠杆菌DH5α。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后,测定序列并分析。【结果】自C57BL/6小鼠肾脏组织获得总RNA,扩增出255 bp的基因片段,成功构建阳性克隆重组子pMD-T-ZFP580,经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的C57BL/6小鼠ZFP580 C端基因cDNA序列与日本RIKEN基因组中心于GENBANK注册(注册号为AK005257)的完全一致,与人ZNF580 C端编码基因cDNA序列比较,核苷酸序列同源性为90%;该cDNA序列所编码的氨基酸序列与人ZNF580基因C端比较,同源性为100%,均编码有3个串联重复的C2H2型锌指蛋白主构域。其氨基酸序列与大鼠、犬、牛比较,同源性分别为100%、100%、98%。【结论】成功克隆C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因,该基因在不同种属间高度保守。

异常血流动力对人脐静脉内皮细胞影响

目的研究异常血流动力对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)分泌ET-1、NO以及ET-1、eNOS、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1 mRNA和蛋白表达水平的影响,初步探讨异常血流动力致动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的机制。方法按照HUVECs所受作用力的不同分为应力组、壁面压力组和正常组。3组在各自作用力持续作用下培养24 h,收集细胞备用。采用酶法和放免法检测ET-1、NO分泌水平,采用qPCR检测ET-1、eNOS、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1 mRNA表达水平,采用蛋白免疫印迹方法检测VCAM-1、ICAM-1和MCP-1蛋白表达。结果壁面压力组ET-1分泌和mRNA表达水平较正常组明显升高,应力组NO分泌和eNOS mRNA表达水平较正常组明显升高;应力组和壁面压力组VCAM-1、ICAM-1和MCP-1的mRNA和蛋白表达较正常组明显增高。结论应力或壁面压力单独作用于HUVECs能够导致其分泌功能和基因、蛋白表达功能紊乱,异常血流动力导致AS的机制与HUVEC功能紊乱有关。

异常血流动力对HUVEC胆固醇代谢的影响及其致AS的机制

目的通过研究异常血流动力对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)摄取、合成及外排胆固醇的影响,进一步探讨异常血流动力和胆固醇代谢在动脉粥样硬化(AS)形成机制中的作用。方法待细胞生长良好后,换用新的含有低密度脂蛋白(LDL)和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的培养液,同时施加作用力。按照细胞所受作用力不同,随机分为应力组、壁面压力组、对照组A和对照组B。在各自作用力的作用下培养24 h。收集细胞和培养液待用。用酶法检测4组培养液中LDL浓度和胆固醇浓度。用高效液相色谱法检测HUVEC内和细胞膜中胆固醇的含量。分别用实时定量RT-PCR法和蛋白免疫印迹法检测低密度脂蛋白受体(LDLR)、羟-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CR)、ABCA1的mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组B相比较,应力组培养液中LDL含量明显减少,细胞内胆固醇含量明显增高,而且LDLR和HMG-CR的mRNA和蛋白表达明显增高。壁面压力组培养液中胆固醇含量明显增高,细胞膜中胆固醇含量明显降低,而且ABCA1的mRNA和蛋白表达明显增高。对照组A培养液中LDL含量明显降低,胆固醇含量明显增高,而且LDLR、HMG-CR和ABCA1的mRNA和蛋白表达均明显增高。结论应力通过上调LDLR和HMG-CR的mRNA和蛋白的表达促进VEC摄取LDL和合成胆固醇,壁面压力通过上调ABCA1的mRNA和蛋白的表达促进内皮细胞膜外排胆固醇。异常血流动力使血管内皮细胞胆固醇代谢平衡紊乱进而引起AS。

异常血流动力对TLR4/NF-κB信号传导通路及其下游炎症因子的影响

目的研究异常血流应力或压力单独作用对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/NF-κB信号传导通路及下游炎症因子:血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)等的影响,探讨异常血流动力导致动脉粥样硬化的机制。方法将生长良好的HUVECs以1×105个/ml密度接种于细胞综合应力刺激实验系统(型号BIO-CCS13)中进行干预。将HUVECs按所受的应力不同分成应力组、压力组和正常组。在各组应力作用下培养一天后收集细胞备用,用q PCR方法测定TLR4、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)、肿瘤坏死因子受体相关因子-6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF-6)、血凝素样氧化低密度酯蛋白受体-1(LOX-1)、核因子-κB(NF-κB)、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的基因表达,用蛋白质印迹方法测定TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1因子的蛋白表达。结果与正常组比较,应力组和压力组TLR4、My D88、TRAF-6、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1m RNA表达水平显著升高(P<0.01),TLR4、LOX-1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论异常血流动力导致动脉粥样硬化的机制可能与激活TLR4/NF-κB信号传导通路和增强下游炎症因子:LOX-1、TNF-α、ICAM-1及VCAM-1等的表达有关。

高职高专院校学生实验实践能力培养模式的探索

面对高职高专医学类院校实验经费不足和仪器设备陈旧的现状,本文就如何培养和提高学生的实验和实践能力这一问题,结合我校的培养模式和我的教学经验提出几点建议。