基于PD-1/PD-L1表达影响探讨四君子汤对NK细胞及结肠癌作用的研究

目的:通过四君子汤探讨PD-1/PD-L1的表达对NK细胞活性、结肠癌细胞HCT116增殖的影响及作用机制。方法:①通过人外周血淋巴分离液分离出NK细胞,构建NK细胞∶HCT116细胞=5∶1的共培养模型,将经200 ng/ml IFN-γ处理的NK细胞设为IFN-γ组,200 ng/ml IL-2处理的NK细胞设为IL-2组(阳性对照组),5 mg/ml四君子汤处理的NK细胞设为SJZ组,100μmol/L奥沙利铂处理的NK细胞设为OXA组(阳性对照组),正常处理的NK细胞设为Con组,分别单独培养NK细胞,与HCT116细胞共培养24 h及48 h,MTT法检测NK细胞及HCT116细胞的增殖情况;加入STAT3信号抑制剂后,即为R-STAT3组、R-SJZ组、R-OXA组。ELISA检测NK细胞及共培养模型中IFN-γ的分泌情况;qRT-PCR检测共培养模型中NK细胞mRNA IFN-γ、STAT3、PD-1的表达以及HCT116细胞中STAT3、PD-L1 mRNA的表达;②建立小鼠结肠癌皮下瘤模型,将小鼠随机分为4组,空白组(CON)、生理盐水组(NACL)、四君子汤组(SJZ)、奥沙利铂组(OXA),分别给药2周后,活体成像技术检测小鼠皮下瘤的荧光强度;ELISA检测小鼠血液中IFN-γ的分泌量;qRT-PCR、Western blot与免疫组化实验分别检测小鼠皮下瘤中PD-L1 mRNA、蛋白及抗体的表达情况。结果:①IFN-γ在一定浓度下可以抑制NK细胞的生长(P<0.05),四君子汤对共培养模型中HCT116具有显著的抑制作用(P<0.01);四君子汤单独使用或与STAT3抑制剂联合使用可有效降低IFN-γ分泌(P<0.05);四君子汤单独使用或与STAT3抑制剂联合使用可降低共培养模型NK细胞中IFN-γ、PD-1、STAT3及HCT116细胞中PD-L1、STAT3 mRNA的表达;②在小鼠动物实验中,四君子汤组的肿瘤荧光强度弱于生理盐水组和空白组(P<0.05);皮下瘤中PD-L1蛋白及抗体低表达(P<0.05),PD-L1的mRNA表达与细胞实验结果一致(P<0.01),且小鼠血液中的IFN-γ在四君子汤组分泌量最低(P<0.05)。结论:四君子汤可以影响NK细胞活性及结肠癌增殖,其功能与STAT3抑制剂相近,可能通过调控STAT3信号干预IFN-γ分泌,降低PD-1/PD-L1表达从而改善NK细胞及抑制结肠癌细胞的生长。

IFN-γ与肿瘤免疫

恶性肿瘤(以下简称肿瘤)是世界范围内人类致死的重要因素之一,其易转移与高复发的特性,导致每年数千万人因此失去生命。近年来研究发现,机体的免疫系统对肿瘤的产生、转移和复发等方面存在着制约作用,而肿瘤微环境中的免疫因子、各种免疫细胞分泌的细胞因子等在抗肿瘤以及免疫调节方面发挥着关键性作用。IFN-γ作为其中之一,在免疫反应中不可或缺,已成为当下研究的主要对象。以下对近几年来基于IFN-γ的肿瘤免疫研究进展进行综述。

中医药对肿瘤微环境中免疫细胞的调节作用

中医药调节肿瘤微环境中免疫细胞的研究包括:免疫细胞与肿瘤微环境的关系和中医药调节肿瘤微环境中免疫细胞的作用。其中,免疫细胞与肿瘤微环境的关系主要包括:免疫细胞在肿瘤微环境中浸润、肿瘤微环境中的免疫细胞功能受损、免疫细胞间相互作用维持肿瘤微环境的免疫抑制等。中医药调节肿瘤微环境中免疫细胞的作用主要包括:中医药改变肿瘤患者的免疫状态、中医药促进免疫活性细胞(主要包括T淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等)的作用、中医药调节免疫抑制细胞(主要包括肿瘤相关巨噬细胞、骨髓来源抑制细胞、调节性T细胞等)的作用等。中医药可通过调控免疫细胞间平衡、改变肿瘤内部浸润情况、增强免疫活性细胞功能、逆转免疫细胞抑制表型极化等方法激活免疫系统状态,从而抑制肿瘤生长和转移。但是,这些实验并未深入涉及相关的机制研究,基础实验研究起步晚,关于中医药调节免疫细胞的分子机制和信号通路方面的研究仍不足。中医药对免疫检查位点调节作用的研究尚不深入。今后,应在中医药如何调节免疫检查位点,调控肿瘤微环境内平衡,干预肿瘤细胞与免疫细胞以及免疫细胞间相互作用从而抑制肿瘤发展和转移方面进行深入研究。

四君子汤调节NKG2A表达影响NK细胞抗结肠癌作用

目的:探讨中药复方四君子汤通过调节NKG2A的表达影响自然杀伤(NK)细胞抗结肠癌的作用。方法:分离、纯化来自健康人外周血NK细胞进行培养,分别构建人NK细胞单培、HCT116细胞单培和NK细胞与HCT116细胞共培模型,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测NK细胞中自然杀伤细胞2族成员A(NKG2A)、白细胞介素(IL)-15及结肠癌细胞中组织相容性白细胞抗原E(HLA-E)mRNA的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NK细胞中IL-15分泌;噻唑蓝(MTT)比色法筛选IL-15的浓度,检测四君子汤和IL-15对NK细胞活性和共培模型中HCT116细胞活性的影响,Real-time PCR检测四君子汤和IL-15对NK细胞中NKG2A和HCT116中HLA-E mRNA表达的影响;使用Anti-NKG2A抗体(M)阻断NKG2A/HLA-E通路,MTT比色法检测共培模型中HCT116细胞增殖情况。结果:与单培组比较,NK细胞和HCT116细胞相互作用引起NK细胞的NKG2A和HCT116中的HLA-E mRNA表达均上调(P<0.05);IL-15 mRNA表达和分泌也增加(P<0.05);IL-15可增强NK细胞活性和抗结肠癌作用(P<0.01),也可上调NKG2A表达(P<0.05);与空白组比较,四君子汤组、四君子汤+IL-15组的NK细胞活性和抗结肠癌作用进一步增加(P<0.01),Real-time PCR结果显示,与空白组比较,四君子汤组和四君子汤+IL-15组中NK细胞NKG2A表达下调(P<0.05),共培模型中四君子汤组HCT116中HLA-E表达下调(P<0.01);与相应未加M组比较,M组与IL-15+M组HCT116细胞增殖被抑制(P<0.01)。结论:NK细胞与结肠癌细胞相互作用可引起NKG2A-HLAE通路活化导致NK功能受损,四君子汤可抑制该信号激活从而恢复NK细胞抗结肠癌作用。