siRNA沉默G6PD表达对人皮肤黑色素瘤细胞生长及凋亡的影响

研究表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与肿瘤的发生、发展、临床表型及治疗和预后有关.为阐明G6PD与肿瘤的关系及其机理,针对人G6PD基因设计3条siRNA和一条无关序列,再据每一序列,合成两条互补并含siRNA正反义链的DNA,退火后与含GFP的载体pRNAT-U6.2/Lenti连接,转染人皮肤黑色素瘤A375细胞,Real-timePCR筛选有效的一条siRNA,经病毒颗粒包装和病毒生产并感染A375细胞,G418筛选后,挑取单个阳性克隆放大培养,Western blotting检测siRNA干扰G6PD效率为88.83%,构建成G6PD缺陷型A375稳转细胞(A375-G6PD!).与野生型A375细胞(A375-WT)比较,A375-G6PD!的G6PD活性仅为21.53%,细胞倍增时间延长,增殖被抑制,克隆形成率降低25%(P<0.05),凋亡细胞数增加2.86倍(P<0.01),SPF增加33.8%(P<0.05),PI增加59.7%(P<0.01),G0/G1期下降27.7%(P<0.01),凋亡相关蛋白P53下降54.7%(P<0.01)、Caspase-3增加2.2倍(P<0.01)和Bcl-2降低21.7%(P>0.05),提示,G6PD缺陷可能通过下调P53蛋白表达和上调Caspase-3的表达,抑制G2/M期向G0/G1期转换的进程,促进A375的凋亡,机理有待于进一步探讨.

PBL教学法在硕士研究生培养中的应用

我国正面临着研究生规模快速扩大,为更好地适应国家、社会和市场的需求,探索高素质和能力强的基础医学硕士培养途径已刻不容缓。文中讨论了PBL教学法在研究生培养中的可行性、教师如何分阶段设置问题,并动态分析了PBL过程中教师及学生的责任和义务及其角色变化。

HPLC同步测定肌酸、磷酸肌酸、腺苷酸及次黄嘌呤类物质

本文用反相HPLC法,以TBA(四丁基氢氧化铵)作离子对试剂,用含13％甲醇的磷酸钾缓冲液进行等比洗脱,同步分离测定了肌酸(Cr)、磷酸肌酸(Crp)、次黄嘌呤(HX)、次黄嘌呤核苷(INO)及AMP、ADP、ATP七种标准品的混合物。结果表明,在210nm波长下,10分钟内上述七种物质均完全分开且基线未漂移,重现性好,是一种简便、快速和可靠的方法。

云南经典型苯丙酮尿症基因Exon-11突变的检测

为了探讨云南省经典型PKU基因突变特征,为基因诊断提供依据,应用PCR-ASO探针斑点杂交和PCR-SSCP分析技术,对14个PKU家系14名患儿的PAH基因Exon-11进行检测.结果:检出两种突变Y356X(TAC→TAA)和V399V(GAT→GTT),突变频率均为714%,前者略高于北方人群,后者低于北方人群.提示:云南PKU患者PAH基因Exon-11突变不同于北方人群。

PCR-SSCP-银染法在基因突变分析中的应用

探讨 Ｐ Ｃ Ｒ－ Ｓ Ｓ Ｃ Ｐ－ 银染法在基因突变检测中的应用． 应用 Ｐ Ｃ Ｒ－ Ｓ Ｓ Ｃ Ｐ－ 银染法分析了苯丙酮尿症患者的 Ｐ Ａ Ｈ 基因外显子４ ， ７ ， １０ ， １１ 和１２ ， 并对部分样品进行 Ｄ Ｎ Ａ 测序． 结果： 检出部分已知突变如 Ｒ２４３ Ｑ， Ｒ４１３ Ｐ 等， 并发现当 Ｓ Ｓ Ｃ Ｐ 带型不同于阳性、阴性对照时， 或是外显子其它突变， 或是内含子碱基变化引起， 也可见于碱基序列正常的样品中． 结论： Ｐ Ｃ Ｒ－ Ｓ Ｓ Ｃ Ｐ－ 银染法在有较好对照， 严格控制影响因素条件下， 简便、实用， 是多样品筛查、 Ｄ Ｎ Ａ 测序前筛查的较好方法．

云南经典PKU基因外显子4、10和12突变的检测

目的：探讨云南经典ＰＫＵ的基因突变特征。方法：应用ＰＣＲˉＳＣＰ和ＰＣＲ－循环测序技术对云南１３个ＰＫＵ家系１４名患儿的ＰＡＨ基因外显子４、１０和１２进行了检测。结果：Ｒ４１３Ｐ、Ｗ３２６Ｘ的突变频率分别是７１４％、３５７％；Ａ／Ｃ杂合频率是１０７１％，同时检测到外显子４的３种异常带型。结论：云南ＰＫＵ患者的基因突变不同于北方人群，Ｐ４１３Ｐ、Ａ／Ｃ杂合率约为北方人群突变的１／２；Ｗ３２６Ｘ则高于北方人群；外显子４的突变也可能高于北方人群。

实时定量PCR测定人皮肤黑色素瘤细胞G6PD的表达

目的建立一种灵敏特异、重复性和稳定性好的检测G6PD表达的方法,以探究G6PD与肿瘤的相关性及其机理.方法用Real-time PCR技术测定了野生型、siRNA干扰型和无关序列对照型人皮肤黑色素瘤A375细胞的G6PD基因表达.绘制出β-actin和G6PD的标准曲线,标定了方法的稳定性和重复性,并以内参照β-actin较对G6PD的量.结果β-actin和G6PD标准曲线的回归系数分别为1.086和0.940;稳定性及重复性验证的Ctβ-actin值变异系数分别为2.46%和1.47%,而CtG6PD值变异系数分别为1.76%和1.87%.以野生型A375细胞作对照,无关序列不干扰A375细胞内源性G6PD基因表达(P>0.05),针对G6PD基因表达的siRNA的干扰效率为49%(P<0.01).结论实时荧光定量PCR在检测细胞G6PD基因表达时具有高灵敏度、高重复性和高稳定性的特点,可进一步用于G6PD与肿瘤的相关性研究.

联合应用STR与A/C连锁分析进行PKU的产前基因诊断

目的：对经典ＰＫＵ快速、高效易推广的产前基因诊断方法进行探讨。方法：用ＳＴＲ－Ａｍｐ－ＦＬＰ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ对云南１３个ＰＫＵ家系的ＰＡＨ基因内ＳＴＲ与Ａ／Ｃ位点进行连锁分析。结果：检出２２４２５２ｂｐ的ＳＴＲ８个等位片段，ＰＩＣ为０６９８、杂合率是５７６９％。用ＳＴＲ和ＳＴＲ加Ａ／Ｃ的１００％基因诊断率是４６１５％和６１５４％，且ＳＴＲ加Ａ／Ｃ对所有家系均能提供信息。完成１例风险胎儿的产前诊断和２例回顾性的基因诊断。结论：以ＳＴＲ－Ａｍｐ－ＦＬＰ为主要手段、辅以Ａ／Ｃ位点分析，是一简便、快速易于在基层医院推广的ＰＫＵ产前诊断方法。

云南彝族人群G6PD基因C1311T突变及单体型研究

目的研究云南彝族G6PD缺乏症患者及健康人群G6PD基因c DNAC1311T突变及复合IVS11T93C突变的单体型,探讨两种突变之间的连锁关系。方法应用SNa Pshot技术检测82例G6PD缺乏症患者、67例健康对照个体G6PD基因C1311T及IVS11T93C突变,用直接计数法计算C1311T突变的基因频率及单体型频率,χ2检验进行两组间比较并统计学分析。结果云南彝族G6PD缺乏症患者和健康对照组1311T突变基因频率分别为0.13和0.15,1311C基因频率分别为0.87和0.85。1311T突变在彝族G6PD缺乏症患者和健康人群间比较差异无统计学意义(P>0.05)。发现c DNAC1311T突变与IVS11T93C突变紧密连锁。男性中存在三种单体型93C/1311T、93C/1311C、93T/1311C,女性中存在四种单体型93T/1311C、93CT/1311CT,单体型93C/1311C未见文献报道,两组人群各单体型分布统计学分析差异无统计学意义(P>0.05)。结论 G6PD基因1311T突变在彝族健康人群和G6PD缺乏症患者中普遍分布,1311T基因频率低于已报道的南亚和东南亚地区的频率,高于中国广东人群突变频率。C1311T与IVS11T93C是紧密连锁的突变位点,在彝族人群中常复合突变,其与G6PD酶活性的关系有待进一步研究。SNPshot方法在G6PD基因分型中有快速、灵敏的特点,并有利于女性杂合子的检出,本研究有助于理解云南省少数民族G6PD基因的遗传多态现象。

云南阿昌族G6PD基因突变G487A在DF213中的表达

为获得阿昌族G6PDWT和G6PDG487A重组蛋白,研究G6PDG487A的结构和功能改变,从云南省德宏州梁河县杞木寨乡湾中村阿昌族聚集地的G6PD缺陷家系先证者和正常阿昌族个体全血提取RNA,经RT-巢式PCR得cDNA,将cDNA克隆至pMD18-Tsimple载体中并测序;错配碱基经定点突变修复后,目的基因亚克隆至pThioHis(A)载体,构建了阿昌族G6PD基因野生型和G487A突变型原核表达载体:pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A。用重组质粒转化E.coli Competent Cells DF213(G6PD defeciency),经IPTG诱导G6PD表达、10%SDS-PAGE电泳检测表达蛋白和紫外340nm定量测定G6PD活性的分析表明,pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A在DF213中成功表达,分子量约为59kDa。IPTG诱导0、3、6、9、和12h后,G6PD活性逐渐增高,G6PD基因WT表达的酶活性约是G487A的20-25倍。表达载体的构建以及G6PDcDNA在DF213中成功表达,为重组酶G6PDG487A的进一步研究奠定了基础。

虚拟实验技术在分子生物学实验教学中的应用

目的建立医学分子生物学虚拟实验教学平台,探索出有效的虚拟实验教学运行机制.方法将昆明医科大学2011级临床专业学生随机分为2组,虚拟实验技术教学组195人,传统实验教学组205人,采用问卷调查了解学生对教学效果的评价,并统计学分析2组期末考试成绩.结果同学对虚拟实验的教学方式接受程度较高,有助于同学对实验实际操作及理论知识的理解和掌握.2组期末考试成绩无统计学差异(P>0.05).结论虚拟实验技术作为一种新的教学手段,具备许多传统实验所不具备的优点,但其不能完全代替传统实验,在医学分子生物学实验教学中,应合理运用虚拟实验与传统实验两种教学手段.

G6PD通过细胞周期蛋白D1/D2调控人黑色素瘤细胞周期的进程

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在人皮肤黑色素瘤A375细胞中处于高表达与高活性状态,但G6PD在黑色素瘤发生发展过程中的作用及其具体机制尚不明确.本文在前期运用siRNA方法构建G6PD敲减的黑色素瘤A375稳转细胞(A375-G6PDΔ)基础上,构建表达载体pBabe-puro-G6PDWT在A375-G6PDΔ细胞中过表达野生型的G6PD基因,从而构建G6PD表达恢复的稳转细胞(A375-G6PDΔ-G6PDWT).3株细胞A375-WT、A375-G6PDΔ和A375-G6PDΔ-G6PDWT经G6PD酶活性测定、MTT测定、克隆形成实验、流式细胞仪分析细胞周期和Western印迹检测.结果显示,A375-G6PDΔ-G6PDWT细胞的G6PD蛋白表达量(0.847±0.080)及其活性(0.394±0.029)分别是A375-G6PDΔ的3.28倍(P<0.01)和7.34倍(P<0.01),分别是A375-WT细胞的91.57%和2.12倍(P<0.05).与A375-WT细胞相比,A375-G6PDΔ细胞G0/G1期细胞数增加,S期细胞数减少,增殖指数PI降低了25.70%(P<0.05),细胞周期蛋白D1/D2、细胞周期蛋白E表达分别下降37.4%、54.3%(P<0.01)和17.3%;而A375-G6PDΔ-G6PDWT细胞呈现G1/S期阻滞解除,细胞周期蛋白D1/D2蛋白分别恢复到A375-WT细胞的89.5%和87.6%,细胞周期蛋白E表达未见恢复,呈现生长增殖和克隆形成率的恢复并接近于A375-WT细胞.结果提示,G6PD通过细胞周期蛋白D1/D2调控人皮肤黑色素瘤A375细胞G1期向S期转换的进程,这为黑色素瘤发病机制的研究提供了新的思路.

PBL结合摄像反馈在留学生分子生物学实验教学中的应用

目的探索PBL结合摄像反馈法在留学生分子生物学实验教学中的应用.方法以2013~2014级5年制医学留学生为研究对象,采取PBL结合摄像法为实验组,传统实验教学法为对照组,比较2组测试成绩、英文口语表达能力、主动学习能力等的差异.结果实验平时成绩、实验理论测试成绩、实验操作测试成绩实验组均高于对照组(P=0.001).期末理论测试成绩实验组也高于对照组(P=0.01);英文口语表达能力、主动学习能力等实验组均高于对照组(P=0.001).结论 PBL结合摄像反馈教学法在留学生分子生物学实验教学中取得了显著的教学效果.

青少年吸毒者免疫细胞、细胞因子和生长激素的改变

目的:通过测定青少年吸食海洛因者外周血中T细胞亚群、Th1/Th2细胞因子和血清中的生长激素,从分子水平探讨吸食海洛因对青少年免疫功能和生长发育的影响。方法:用微量全血直接免疫荧光染色,用流式细胞术检测外周血中T细胞亚群;流式细胞(Cytometric bead array,CBA)技术测定Thl/Th2细胞因子;化学发光法测定生长激素。结果:青少年吸食海洛因组(n=20)CD3+、CD3++CD4+、CD3++CD4+/CD3++CD8+、Th1细胞因子(IL-2,TNF-α和IFN-γ)和Th2细胞因子(IL-4,IL-10)低于健康组(n=23)(P<0.01或0.05);且Th1细胞因子下降程度大于Th2细胞因子(P<0.05);血清生长激素显著高于健康组(P<0.01)。结论:海洛因降低青少年机体免疫功能,对细胞免疫的损伤大于体液免疫;海洛因能升高青少年血清生长激素,机制需进一步探讨。

异常激活的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶通过上调周期蛋白D1表达促进肾透明细胞癌增殖

葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PD)为磷酸戊糖途径的调节酶。研究表明,G6PD与多种恶性肿瘤的发生密切相关。然而,G6PD在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中的功能及其作用机制却鲜有报道。本研究通过TCGA数据分析发现,G6PD在肾透明细胞癌TNMⅢ/Ⅳ期mRNA表达水平显著升高,与患者的性别、原发肿瘤直径、淋巴结转移、远端转移、病灶一侧的偏重性、病理分级以及TNM临床分期密切相关。并且,G6PD异常激活有可能成为评价肾透明细胞癌患者不良预后的分子。细胞系检测结果提示,与对照293T细胞及恶性程度较低的786-O细胞相比,恶性程度较高的Caki-1细胞中的G6PD表达及活性明显增加。基因稳定转染结合CCK8分析结果显示,G6PD过表达或异常激活可显著提高293T及786-O细胞的增殖能力,并且促进786-O细胞中周期蛋白D1基因表达上调。综上,本研究通过TCGA数据库分析和稳定细胞系检测及CCK8分析,结果显示,G6PD在肾透明细胞癌中异常激活,并可上调细胞周期蛋白D1表达,进而促进肿瘤细胞增殖。该研究为进一步揭示肾透明细胞癌分子发病机制以及开发有效的靶向治疗方案提供了借鉴。

互动式教学模式在医学分子生物学教学中的应用

目的探讨互动式教学法在分子生物学课堂教学中的效果.方法 2007级和2008级本科学生的分子生物学课程教学中尝试了互动式教学模式,并对这两个年级的学生进行问卷调查.结果绝大部分学生认为互动式课堂教学能激发学习兴趣,提高自学能力、思考能力、创新能力、语言表达能力,能增进团队合作精神,能较好地引导本学科与相关学科知识的联系.结论互动式教学有利于培养学生的创新能力,提高学生的综合素质,在医学分子生物学课堂教学中的尝试是基本成功的.

G6PD缺陷抑制人黑色素瘤细胞裸鼠移植瘤的生长

敲减葡糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)表达的人黑色素瘤A375细胞(A375-G6PDΔ)呈现生长增殖抑制和凋亡率升高.为明确G6PD缺陷对裸鼠体内成瘤的影响及其可能机制,用A375-WT与A375-G6PDΔ细胞制作裸鼠荷瘤模型,观察体内瘤体生长,real-time PCR、免疫组织化学染色与紫外分光光度法分别检测瘤体组织G6PD mRNA、G6PD蛋白及酶活性,Western印迹分析凋亡相关蛋白,分光光度法测定NADPH和GSH/GSSG水平.结果显示,A375-G6PDΔ细胞注射组的裸鼠成瘤时间延长,瘤体生长明显减慢,瘤体的体积与质量显著低于A375-WT细胞注射组(P<0.01);与A375-WT细胞注射组相比,A375-G6PDΔ细胞注射组的裸鼠瘤体组织中G6PD mRNA表达、G6PD阳性细胞数与G6PD活性分别降低了87.10%、77.20%与75.77%(P<0.01),G6PD、p53和Bcl-2的表达分别降低了67.92%、65.54%和62.32%(P<0.01),Fas升高了86.38%(P<0.01),NADPH和GSH/GSSG分别降低了74.37%和86.02%(P<0.01).结果提示,G6PD缺陷可能通过减少核酸等合成的原料、改变细胞内氧化还原状态及凋亡相关蛋白表达抑制裸鼠瘤体生长与增殖,这为黑色素瘤发生和治疗研究提供了新的线索.

初情期前云南滇南小耳猪超数排卵和原核期胚胎体外发育的研究

目的对初情期前云南滇南小耳猪超数排卵和原核期胚胎体外发育进行研究.方法对8头初情期前云南滇南小耳猪注射1000IUPMSG和500IUhCG诱导超数排卵,以自然交配和人工授精技术、手术或离体冲卵技术回收原核期胚胎,并进行胚胎体外培养研究.结果超排的激素处理方法可成功诱导超生理数量的卵子发育和排卵及受精,最多可得到31枚受精卵.受精卵的囊胚率可达到87.5%.经过比较研究,人工授精可能优于自然交配的授精方式;雌激素可作为初情期前小母猪的超排成败的重要标志.但是,手术法冲卵的技术较离体冲卵的还很低.结论初情期云南滇南小耳猪可用于体内胚胎生产,其原核期胚胎体外发育具有比较高的的发育潜能.

黑色素瘤发生发展中的表观遗传学调控

人恶性黑色素瘤(malignant melanoma)是近年来高发病率和高死亡率的肿瘤之一.目前尚缺乏有效的治疗方法.而表观遗传如DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白修饰(histonemodification)、染色质重塑(chromatin remodeling)及RNA干扰(RNA interference,RNAi)等改变在人黑色素瘤的发生、发展和转移中有重要作用.阐明黑色素瘤发生发展的表观遗传学机制已引起了学者的普遍关注.本文综述了人类黑色素瘤发生发展中所特异的表观遗传改变:CpG岛的异常甲基化修饰、组蛋白甲基化和乙酰化修饰、染色质重塑以及microRNA在黑色素瘤发生和转移中的作用,并对应用表观遗传修饰治疗人类黑色素瘤进行了探讨.