氯菊酯异构体对人类绒毛膜癌JEG-3细胞内分泌的选择性干扰

以人类绒毛膜癌JEG-3细胞为模型,通过考察拟除虫菊酯类农药氯菊酯(permethrin,PM)及其异构体对JEG-3细胞内分泌相关基因的干扰情况,探讨了氯菊酯及其异构体暴露对产妇胎儿健康的潜在风险。通过高效液相色谱拆分得到氯菊酯的4个异构体,采用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测目的基因的相对表达水平,发现氯菊酯异构体对JEG-3细胞促性腺激素释放激素(Gn RHI,Gn RHII)及其受体(Gn RHR)、胆甾醇类雌激素合成关键基因以及胚胎免疫耐受相关基因(HLA-G)在m RNA水平的相对表达量均呈现选择性干扰,其中1R-cis-PM和1S-trans-PM对滋养层细胞内分泌相关基因表达量的影响大于其他2个异构体。

吡唑硫磷对映体对东亚飞蝗的对映选择毒性及其机制研究

通过比较吡唑硫磷(pyraclofos)两种对映体对东亚飞蝗1型乙酰胆碱酯酶基因Lm-ace1转录水平、乙酰胆碱酯酶(AChE)活性影响以及其对AChE活性抑制的差异,探究吡唑硫磷对映体在东亚飞蝗体内毒性差异产生的机理。利用HPLC法拆分吡唑硫磷。分别对三龄若虫点滴得到的两种手性对映体,24h后计算LD50值,并检测实验虫体各组AChE的活性,采用RT-PCR检测Lm-ace1mRNA的表达水平。提取对照组AChE粗酶液进行体外抑制实验检测。结果表明:(+)/(-)-吡唑硫磷的半致死量LD50分别为0.398mg·kg-1虫重和36.535mg·kg-1虫重。在AChE体外活性抑制实验中,随着(+)/(-)-pyraclofos浓度的增加,农药对东亚飞蝗AChE的抑制程度也在逐渐增强。吡唑硫磷对映体对东亚飞蝗具有显著的毒力差异,两种对映体对飞蝗Lm-ace1不同的诱导表达活性以及对AChE不同的抑制活性是造成这种毒性差异的部分原因。

人GPR81-Gi1α融合蛋白在杆状病毒系统中的表达及优化

旨在建立获得融合蛋白GPR81-Gi1α的方法和最优条件。采用RT-PCR从人胚胎肾及大脑组织总RNA中分别扩增孤儿G蛋白偶联受体GPR81和Gi1α的完整表达序列(分别为1 041bp和1 065bp),并构建各自的重组质粒pcDNA3.1(+)-GPR81及pcDNA3.1(+)-Gi1α,再以重组质粒为模板,运用重叠延伸PCR法扩增得到融合基因GPR81-Gi1α,测序无误后将融合基因与pFASTBac1重组得重组质粒pFASTBac1-GPR81-Gi1α,而后转化DH10Bac,使该融合基因重组质粒发生特异性的转座和病毒重组,获得杆状病毒表达穿梭质粒pBacmid-GPR81- Ci1α,再将该重组杆粒转染昆虫sf9细胞,获得含杆状病毒的细胞分泌上清,以上清在不同条件下(包括不同感染时间、滴度等)感染sf9细胞以优化融合蛋白在昆虫sf9细胞的表达条件。结果表明,感染72h且感染强度moi为5时是融合蛋白在sf9细胞中高效表达的理想条件。该表达体系的建立及蛋白表达条件的优化,保证了足量GPR81- Gi1α融合蛋白的制备。

链脲佐菌素诱发糖尿病性肾病大鼠模型的特点

目的：建立糖尿病性肾病（diabetic nephropathy，DN）大鼠模型，观察DN发生发展过程中大鼠肾脏相关功能及结构的变化特点。方法：二级Wistar雄性大鼠60只，体质量180～220g，分为2组：正常对照组和模型组各30只。模型组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ，65mg／kg），正常对照组注射等量的枸橼酸缓冲溶液。在注射后第6、10、12、16和32周，分别动态监测大鼠的体质量、血糖、24h尿蛋白和肌酐、肾脏质量及病理改变等。结果：随着病程的发展，模型组大鼠持续高血糖，体质量明显降低，24h尿蛋白、尿蛋白／尿肌酐比值则逐渐升高，肾脏明显肥大，而且肾小球和肾小管病变在第10周开始出现，之后病变程度逐渐加重、病变范围不断扩大，表现出较为典型的DN变化特点，诸如肾小球系膜增厚、细胞外基质增生及肾小管间质损伤等。结论：STZ可成功诱导大鼠持续性高糖血症，后者的进一步发展，又可引起大鼠肾脏功能受损和形态改变。高糖血症持续12周后，DN大鼠模型的明显特征开始显现。

两种黑色素瘤B16细胞肺转移小鼠模型的构建和比较

目的采用尾静脉接种法建立C57BL/6小鼠和KM小鼠两种黑色素瘤B16细胞肺转移动物模型,观察小鼠肺部成瘤过程,并对两种模型进行比较。制作肿瘤切片,通过HE染色分析两种肿瘤模型的组织病理学特征。方法培养B16黑色素瘤细胞至对数生长期时收集细胞,用生理盐水调整浓度为5×106/ml备用。将备好的B16细胞通过尾静脉接种小鼠,每只注射0.2 ml。接种后,两种小鼠每隔一定时间随机各取一只小鼠处死,解剖取肺,观察成瘤情况,计数肺表面的瘤结节数,测量瘤结节大小。以出现瘤结节开始计时,记录小鼠荷瘤时间。形成稳定的肿瘤模型后,制作肿瘤组织切片,HE染色进行病理学观察分析。结果 B16细胞尾静脉接种C57BL/6小鼠和KM小鼠,均能形成肺转移模型,但两种小鼠成瘤情况差异较大。KM小鼠的荷瘤时间比C57BL/6小鼠荷瘤时间长。HE染色结果显示黑色素瘤B16细胞在两种小鼠的肺组织中均形成巢团状的转移瘤,且两种模型肺转移瘤均多分布在支气管周围。结论通过对C57BL/6小鼠和KM小鼠两种黑色素瘤B16细胞肺转移小鼠模型的成瘤特点的分析比较,可以看出KM小鼠更适合用于研究新的肺肿瘤治疗药物,为研究黑色素瘤的发生发展提供依据。

α-酮戊二酸钠对CHO-hGPCRc细胞内游离钙离子浓度的影响

目的:研究α-酮戊二酸钠对CHO-hGPCRc细胞内钙离子浓度的影响,并分析其变化的原因,从功能上进一步鉴定人源G蛋白偶联受体hGPCR c表达细胞的可靠性。方法:将重组表达质粒pcDNA3.1(+)-hGPCRc转染入CHO-K1细胞,经G418(800μg/m l)作用7~10 d,挑选、扩增阳性克隆,得到CHO-hGPCR c细胞,再以RT-PCR检测所得细胞内hGPCRc mRNA的表达;然后用不同浓度的α-酮戊二酸钠诱导该细胞,通过激光扫描共聚焦显微镜观察F luo-3标记细胞内钙离子变化,以及细胞外钙离子对其影响。结果:(1)RT-PCR结果表明,所得CHO-hGPCR c细胞能够稳定表达hGPCR c的mRNA;(2)α-酮戊二酸钠可引起细胞内钙离子浓度的变化,表现为钙波动幅度明显增加,并呈浓度依赖性;(3)α-酮戊二酸钠引起的细胞内钙波动,不是细胞外钙离子内流所致,而是细胞内钙库动员的结果。结论:α-酮戊二酸钠为hGPCRc的特异性配基,CHO-hGPCRc细胞能够稳定表达具有功能活性的hGPCRc受体,为进一步开展hGPCRc研究奠定了基础。