肝硬化患者发生的肝细胞癌差异表达基因文库的构建及初步筛选

目的 与肝硬化对比 ,研究肝细胞癌中差异表达的基因 ,构建在肝硬化基础上发生癌变的肝细胞之差异表达的cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交获得差异表达基因片段 ,T/A克隆 ,蓝白斑筛选 ,在自动测序仪上进行基因测序 ,做同源性分析。结果 经过巢式PCR扩增后 ,得到差异表达的cDNA ,琼脂糖凝胶电泳显示为一弥散条带 ;3 5个差异表达的克隆被分离 ,基因表达序列标签长度在 112～ 75 5bp之间。序列分析揭示 2 8个克隆是来自以前描述过的基因 ,而另外 7个在GenBank/EMBL/DDBJ数据库没有匹配序列 ,可能代表新基因。结论 实验结果表明从肝硬化发展至肝细胞癌涉及到多个基因的差异表达 ;本研究在成功地构建出消减基因文库的同时 ,也证明了抑制性消减杂交技术对寻找差异表达基因是十分适用的。

青年人大肠癌细胞p53蛋白表达和DNA的定量研究

目的：研究青年人大肠癌抑癌基因ｐ５３蛋白的表达和细胞ＤＮＡ含量。方法：采用流式细胞光度术（ＦＣＭ）。结果：青年组大肠癌细胞ＤＩ值（１．３０±０．１７）显著大于老年癌组（１．１０±０．０９）（Ｐ＜０．０１），且细胞增殖指数（ＰＩ）亦明显大于后者（２４．９％±６．５％ｖｓ２０．２％±４．７％）（Ｐ＜０．０５）。青年组大肠癌中ＤＮＡ异倍体癌发生率为８７．１％（２７／３１），而老年癌组仅为２８．６％（４／１４），两者之间差别有高度显著性（Ｐ＜０．００１）。ｐ５３蛋白表达量青年患者（ＦＩ＝１．３４±０．２６）显著大于老年患者（ＦＩ＝１．１５±０．２５）（Ｐ＜０．０１）。在青年大肠癌中，粘液癌和侵犯周围软组织者，其ｐ５３蛋白的阳性表达率（１００％，９５％）分别高于腺癌和浸润较浅者（６７％，５８％）（Ｐ＜０．０５），而且低分化癌和有局部淋巴转移者ｐ５３蛋白的表达阳性率（９３％，１００％）也较高、中分化癌和无局部淋巴结转移者（６９％，６８％）为高。结论：在ＤＮＡ水平上，青年大肠癌的恶性程度高于老年大肠癌；ｐ５３蛋白的高表达可能是造成青年大肠癌恶性度高的原因之一。

青年人大肠癌的临床与实验研究

目的探讨青年人大肠癌的临床病理特点、细胞DNA含量以及P53，C-erbR-2，nm23的蛋白表达情况．方法进行了青年人大肠癌（35例）临床病理资料的回顾性研究，DNA含量的流式细胞学分析以及基因蛋白表达的免疫组织化学检测．结果青年人大肠癌中20岁以下者较少见，从21岁开始则有随年龄增长而增加之趋势，以直肠癌最为多见；临床分期上Ⅲ，Ⅳ期病例较多，年龄愈小晚期癌的发生趋于增多；生长方式以浸润肠壁全层和周围软组织为主；组织学特点粘液腺癌所占比例较高（41．9％），并多见印戒细胞癌，分化程度较差；浸润及局部淋巴结转移较快，一旦转移，手术效果很差．在DNA水平上青年人大肠癌的非二倍体癌发生率及细胞增殖指数均显著高于老年大肠癌（P＜0．01），G-erbB-2，P53蛋白的表达青年组大肠癌阳性率明显高于老年组，而青年人大肠癌nm23／NDPK则呈降低表达．结论青年人大肠癌的病理组织学特点可能与DNA增殖快，G-erbB-2激活和P53，nm23的突变相关．

人肝细胞癌差异表达基因TCTP的克隆和分析

目的 筛选和鉴定在人肝细胞癌中差异表达的基因。方法 采用抑制性消减杂交技术建立人肝细胞癌cDNA消减文库,通过DNA测序分析、Northern印迹、cDNA末端快速扩增和RT-PCR等方法对其中一个克隆基因加以分析。结果 从所建cDNA消减文库中分离到一个插入子长度为479bp的克隆,该片段含有3’端Poly(A)结构,Northern杂交证明其表达水平在癌组织和肝癌细胞株均显著升高,同时经5’末端快速扩增获得一个长度为865bp的全长cDNA序列,具有一个编码172个氨基酸的完整开放阅读框,与GenBank数据库作同源性分析显示其为已报道的TCTP基因。RT-PCR分析表明TCTP基因在癌组织样本中的扩增水平高于癌旁非癌组织样本。结论 TCTP基因的差异表达可能在肝癌发生机制中扮演重要角色。

癌基因c-erbB-2与肿瘤

癌基因ｃ┐ｅｒｂＢ┐２与肿瘤朱武凌李钦选综述杜华贞和瑞芝审校作者单位：河南省新乡医学院病理学教研室４５３００３作者简介：朱武凌，男，２７岁，硕士。研究方向：消化道恶性肿瘤基因表达及癌的阻断和瑞芝，女，５７岁，教授，享受国务院特殊津贴。研究方向：食管癌...

获得性免疫缺陷综合征的消化系病变研究现状

消化系病变作为获得性免疫缺陷综合征—艾滋病（Ａｃｑｕｉｒｅｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）的常见临床表现之一，可累及自口腔至直肠的整个消化道以及肝、胆、胰等脏器。艾滋病的治疗中由于消化系统症状得不到有效控制，常出现营养代...

青年与老年结直肠癌C -erbB - 2不同表达与DNA倍体的关系

目的 探讨青年和老年结直肠癌 (CRC)患者C -erbB - 2蛋白的表达与病理学和细胞DNA倍体的关系。方法 采用免疫组化法检测 63例青、老年CRCC -erbB - 2 ,流式细胞学分析青年和部分老年患者的DNA倍体。结果 C -erbB - 2蛋白阳性表达在 31例青年CRC中有 1 4例 (45 .2 % ) ,而 32例老年CRC中仅 4例 (1 2 .2 % ) (P <0 .0 1 ) ;癌的DNA非二倍体发生率青年组为 87.1 % (2 7/ 31 ) ,老年组为 2 8.6 % (4/ 1 4 ) (P <0 .0 0 1 )。在腺癌、高 -中分化、无局部淋巴结转移及浅度浸润的癌中 ,青年组C -erbB - 2蛋白的阳性表达和非二倍体发生率均高于老年组 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 0 1 )。结论 青年和老年CRCC -erbB - 2蛋白表达不同与细胞DNA倍体密切相关 。

TCTP mRNA在肝再生中的表达及其生物学意义

目的:探讨翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)mRNA在肝再生中的表达情况和生物学意义.方法:对健康成年雄性SD大鼠进行2/3部分肝切除以建立肝再生模型,分别于肝切除术后不同时间点收集再生肝组织,在显微镜下进行有丝分裂指数评价,利用流式细胞术分析细胞周期分布变化;半定量RT-PCR法检测TCTP mRNA的表达.结果:肝细胞有丝分裂指数在术后3～12h明显升高.细胞周期分析显示,肝切除术后1h呈现G0/G1向S期迁移,G2/M期细胞比例在3h呈现升高,6h升高最为显著.TCTP mRNA的表达在肝切除术后1h时轻微上调,在3～12h呈显著升高,之后下降至初始水平.结论:在肝再生组织中TCTP mRNA表达呈动态变化,可能与有丝分裂和细胞增殖密切相关.

青年结直肠癌c-erbB-2蛋白高表达的病理学意义

目的 :探讨青年结直肠癌c erbB 2表达与临床病理特点之间的联系。方法 :采用流式细胞术对c erbB 2蛋白在青、老年结直肠癌中的表达加以定量检测和对比分析。结果 :青年组 62例中共有 46例c erbB 2阳性表达 ,而老年组 3 2例中有 15例阳性表达 ,二者之间差异有统计学意义 ,P <0 0 5。c erbB 2高表达与青年患者肿瘤组织学类型和浸润深度无明显关系 ,但与肿瘤分级和淋巴结转移密切相关 ,P <0 0 5 ,即分级高或有局部淋巴结转移的多呈高表达 ;反之 ,则几乎均为低表达或无表达。与老年组对比 ,青年组分化程度低、浸润周围软组织或局部淋巴结发生转移的c erbB 2表达量显著升高 ,P <0 0 5。结论 :c erbB 2蛋白的表达对于判断青年结直肠癌恶性程度及预后具有重要病理学意义。

青年人大肠癌P53蛋白过表达与组织学类型和深度浸润的关系

目的探讨青年人大肠癌在临床表现上恶性程度高的原因。方法采用免疫组织化学和流式细胞术同时检测经手术切除的癌组织P53蛋白的表达。结果免疫组织化学染色结果发现青年组P53蛋白表达阳性率明显高于老年组(P<0.05),流式细胞术定量分析亦显示青年组P53蛋白表达量(FI=1.34±0.26)显著大于老年对照组(FI=1.15±0.25)(P<0.01)。结合病理学进一步分析发现:在青年组中黏液腺癌和浸润周围软组织者的P53阳性率(100%,95%)均分别显著高于腺癌和浸润未达周围软组织者(67%,58%)(P<0.05)。另外,与老年组比较,青年组在黏液腺癌和癌浸润至周围软组织的发生率等2方面均明显升高(P<0.05),同时相应的P53蛋白表达阳性率亦是如此(P<0.05)。结论P53蛋白过表达与青年人大肠癌组织学类型和深度浸润密切相关,可能是造成青年人大肠癌恶性程度高的原因之一。

大鼠部分肝切后血清对体外培养肝细胞的刺激作用

目的探讨大鼠部分肝切后血清对体外培养肝细胞生长状况的影响。方法对Sprague-Dawley大鼠进行肝部分切除,分别在术后第12、24、36h于心腔内穿刺取血,制备刺激血清。采用酶消化法分离获取Sprague-Dawley乳鼠的肝细胞,在加有10%上述刺激血清的DMEM培养基中进行肝细胞体外培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状态,采用免疫细胞化学方法检测肝细胞中白蛋白和纤维蛋白原的表达情况。结果发现在肝切后血清刺激作用下,原代培养的肝细胞生长加快,存活时间增长。细胞传代培养后仍用制备血清加以刺激,可产生胶原样细胞外基质,并且在基质上粘附的肝细胞呈现克隆样生长状态,其胞浆内白蛋白和纤维蛋白原均呈阳性表达。结论研究初步表明,体外培养乳鼠肝细胞时加入大鼠部分肝切后血清,可以有效刺激细胞的生长,促进细胞外基质的产生,从而利于肝细胞在体外较长时间存活、增殖和功能保持,同时此种肝细胞体外培养方式还为肝脏细胞生物学研究增添了新的实验途径。

人肝癌细胞差异表达基因纤维蛋白原γ-多肽的克隆与鉴定

背景与目的:肝细胞癌(肝癌)的发生、发展与基因的异常表达有关,但详细机制还不清楚,原因在于目前所知的遗传学信息尚欠充分;本研究旨在探索新的人肝癌细胞差异表达基因。方法:应用抑制性消减杂交技术获得肝癌细胞消减cDNA,以T/A方法进行克隆,通过DNA测序分析、Northern印迹杂交、cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAend,RACE)和RT-PCR等方法加以鉴定。结果:在被克隆的消减cDNA之中,一个长度为787个核苷酸的差异表达cDNA片段经Northern印迹分析,发现其在两种人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2中的表达均明显高于正常肝细胞;经过RACE后获得一个长度为1597bp、具有3'端polyA结构的基因序列,它含有完整的开放阅读框,编码437个氨基酸,经同源性分析证实该基因为编码人纤维蛋白原γ-多肽(fibrinogengammapolypeptide,FGG)的基因;RT-PCR分析证明癌组织中FGGmRNA表达水平较癌旁非癌组织明显增加,尤其是在肝癌转移灶中。结论:SMMC-7721和HepG2细胞中发现FGG高表达,FGG基因的上调表达是肝癌病理过程中一个重要分子事件。

人骨髓单个核细胞向肝细胞诱导分化的体外研究

目的 探讨在HGF、FGF_4诱导下骨髓单个核细胞能否向肝细胞分化。方法 找健康忐愿者,年龄4～50岁,胸骨抽取骨髓,用淋巴分离液分离出骨髓单个核细胞,用含2％胎牛血清和1×ITS的DMEM培养,分别用单独HGF、单独FGF_4、HGF和FGF_4联合刺激、无生长因子4种处理因素进行诱导培养,分别于诱导培养0、7、14、21、28天时,留取细胞,用免疫细胞化学法检测CK18、AFP、白蛋白,用PAS法进行糖元染色试验以验证诱导分化的结果。结果 0天时,AFP、白蛋白少数细胞阴性,CK18阴性,糖元未见阳性;加生长因子的三组AFP在7、14天时表达逐渐增高,21、28天减弱;糖元、CK18、白蛋白表达逐渐增高。无生长因子组,在7、14、21、28天时,这此指标均未见表达。结论 在HGF、FGR_4诱导下,骨髓单个核细胞可分化为具肝细胞表型和功能的细胞。

大鼠移植骨髓细胞向肝细胞转化的实验研究

目的 探讨体内骨髓细胞向肝细胞转化的可行性。方法 将雌性 SD大鼠随机分为3组,每组15只。①R+BMT(全身照射+骨髓移植);②2-AAF+R+BMT:③2-AAF+PH(部分肝切)+BMT。进行交叉性别骨髓细胞移植,雄性骨髓植入雌性受体,分别于第5、10、20天处死雌鼠。以雄性性别决定基因sry作为细胞标记,用原位杂交和FISH作为检测方法对骨髓细胞的肝细胞转化进行分析。结果 PCR移植效果初步分析可见,R+ BMT组11例中有10例PCR阳性;2AAF+PH+BMT组11例中有7例阳性,2AAM+R+BMT组10例中有6例阳性。sry原位杂交染色发现,第5天各组雌性受体肝索中均未见sry阳性的肝细胞。第10天R+BMT组可见1例sry阳性的细胞位于肝细胞索,FISH染色可见这一细胞白蛋白mRNA阳性。第20天各组PCR阳性各例均可在肝索中检测到sry阳性的细胞。FICH染色可见白蛋白mRNA阳性。经统计学分析第20天各组sry阳性细胞数无明显差异。结论 在R+BMT、2-AAF+PH+BMT和2-AAF+R+BMT模型中移植的骨髓细胞均可以植入肝脏,并存在于肝细胞索。植入肝索的骨髓细胞最早可见于移植后第10天,并发生转分化,表达白蛋白mRNA。不经过全身照射的2-AAF+PH+BMT组,移植的骨髓细胞也可以进入肝脏发生转分化,因此全身照射并不一定是移植骨髓细胞活化、植入和转化的必须条件。

MicroRNA-100对肝癌细胞增殖活力和细胞周期的影响

目的:探讨microRNA-100(miR-100)对肝癌细胞增殖活力和细胞周期的影响及其可能机制。方法:通过脂质体介导将人工合成的miR-100模拟物及其阴性对照转染人肝癌HepG2细胞,用细胞计数试剂盒8(CCK-8)方法检测转染后HepG2细胞的增殖活力,用流式细胞术判定细胞周期分布,并进一步用实时荧光定量RT-PCR和Western blotting分析Polo样激酶1(Plk1)的表达水平。结果:荧光显微镜下观察到经阳离子脂质体介导的细胞转染效率大于85%。转染miR-100模拟物的实验组细胞的增殖抑制率在24、48和72 h分别为(43.5±12.2)%、(46.5±3.7)%和(52.1±0.2)%,均显著高于对照组细胞(P<0.01),并且在72 h实验组细胞增殖指数(35.8±1.4)低于阴性对照组(39.2±1.0)和单纯脂质体组(40.7±2.0)(P<0.05)。同时与对照组相比,实验组细胞Plk1 mRNA和蛋白表达水平在转染miR-100后72 h明显降低(P<0.05)。结论:miR-100可抑制肝癌细胞增殖,其机制可能与其下调Plk1的表达有关。

人骨髓多能成体祖细胞的分离培养及向肝细胞样细胞分化的研究

目的 培养人骨髓多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells,MAPCs)并研究其向肝细胞样细胞的分化。方法应用体外细胞培养技术将人骨髓中的单个核细胞从无血液疾病患者的髂嵴骨髓中分离出来后,用磁式细胞分离仪分离富集骨髓单个核细胞中的CD45^-HLA-DR^-细胞,把其接种于DMEM培养基中进行培养,到达对数生长期时,加入成纤维细胞生长因子-4(fibrob-last growth factor-4,FGF-4)并改用维持液来诱导其向肝细胞样细胞分化,最后用免疫细胞化学方法检测其分化情况。结果 成功地进行了人骨髓MAPCs的原代和传代培养,并在体外成功地把其诱导分化为具有肝细胞表型特征的细胞。结论 FGF-4可诱导人MAPCs向具有肝细胞表型特征的细胞发生分化。

肝细胞癌高表达基因片段P02的全长RACE扩增和序列分析

目的扩增肝细胞癌高表达基因基因P0 2的全长cDNA序列,并利用生物信息学知识对其进行分析,为进一步研究该基因在肝细胞癌发生、发展中的作用奠定基础。方法运用SMARTRACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)技术扩增P0 2的5’和3’末端cDNA ,对RACEPCR产物作TA克隆,碱裂解法抽提阳性克隆质粒,酶切和PCR验证目的片断的插入,Sanger双脱氧链中止法测序,利用BLAST、基因探索者等生物学软件对序列进行分析、拼接,获得全长cDNA ,利用在线预测软件预测该基因的生物学功能。结果获得865bp的全长cDNA序列,其开放读码框长172个氨基酸,与TPT1基因高度同源,是一个生理功能尚未完全明了、与生长相关的蛋白质,蛋白质结构和功能预测提示该基因产物可能是一个位于细胞膜的与生长相关的裂解酶。结论在肝细胞癌组织中成功克隆扩增了长865bp的P0 2全长cDNA序列,为进一步功能研究奠定基础。