粉尘螨Der f18变应原的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA,采用RT-PCR方法有效地扩增出Der f18片段,将Der f18连接到pET-24a表达载体上并转化到表达菌BL21(DE3)中,得到重组质粒pET-Der f18和重组工程菌。重组工程菌经IPTG诱导培养,高效表达出Der f18蛋白,SDS-PAGE结果显示表达产物约为52kDa。表达产物经亲和层析纯化,用Western blot方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性。

粉尘螨6类变应原(Derf6)的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定

目的构建粉尘螨6类变应原(Dermatophagoides farinae,Derf6)基因的高效原核表达载体,并进行表达、纯化及生物学功能分析。方法根据Derf6基因已知序列,设计1对引物,通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Derf6基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌(E.coliTop10),经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Derf6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,经纯化后连接并转化至E.coliTop10。构建的重组质粒pET24a-Derf6经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至E.coliBL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Westernblotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Derf6表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Derf6和pET24a-Derf6。SDS-PAGE结果表明Derf6基因在E.coliBl21(DE3)中获得良好的表达,所得重组蛋白相对分子质量(Mr)为31000,与理论值一致,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Westernblotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Derf6。

德国小蠊变应原Bla g 2蛋白变复性的荧光光谱研究

包涵体中的重组蛋白经抽提后可以在变性状态下纯化,而纯化后的复性过程是基因工程下游处理的重要环节。通过对变应原Bla g 2蛋白复性前后荧光光谱的比较和分析、变性剂(尿素和SDS)对复性后Blag 2蛋白的荧光滴定实验、以及复性后Bla g 2在不同pH下的荧光光谱分析,推断出Bla g 2蛋白分子在不同环境下构象的变化及其光谱学特征,初步建立了一种新的检测重组变应原蛋白变复性的光谱实验方法。