鸭血超氧化物歧化酶(SOD)的纯化及性质研究

超氧化物歧化酶(E、C、1.15.1.1)是催化超氧阴离子起歧化反应的金属酶类,血红细胞中的SOD属Cu Zn—SOD。本文详细报道了从鸭血分离纯化SOD的改进方法(同时用猪血作对比研究)。设计了热变性、(NH_4)_2SO_4分级监析、低浓乙醇—氯仿短时去除残留血红蛋白、凝胶层析四步纯化方案,获得高产率电泳纯SOD。用紫外扫描,PAGE电泳后考马斯亮蓝和SOD活性杂色,SDS—电泳,HPLC分离和各电泳带组分的N—端测定等技术检测纯度,并进行性质研究。证明所得SOD是均一的;N—端为Ala;分子量和亚分子量各为32,359和16,500dt;并与猪血SOD对比研究其某些性质;对HPLC出现的多个活力峰及PAGE电泳显现的多条活性带进行了讨论。

高纯度超氧化物歧化酶制备方法的改进

本文报道了制备超氧化物歧化酶的方法,即首先75℃下加热处理15min,然后用硫酸铵分级盐析,再用少量乙醇、氯仿处理,最后经分子筛层析,可得到高纯度的产品。从1000ml猪红细胞中,可得到46.5mg酶,比活力达每毫克蛋白14200u.1000ml码红细胞,可得到30mg酶,比活力达每毫克蛋白16600u.所得产品经disc-PAGE,SDS-PAGE,N-末端氨基酸分析等检测,均表明已达均一程度。此法可减轻环境污染,操作简便,经济实用,适用于工厂化生产。

超氧化物歧化酶的某些性质及胰酶酶解的研究

按本室制备方法,从1000ml 鸡红细胞中得30mg 纯超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD),比活力为16600u/mg,经检测所得酶是均一的。用 DNS 法测得该酶 N-末端氨基酸为丙氨酸。在紫外和可见光区的特征吸收峰分别在260nm 和680nm,用 Sephadex G-100凝胶过滤法测得分子量为33800道尔顿,经 SDS—PAGE 测得其亚基分子量为16500道尔顿,由大约154个氨基酸残基组成,不含色氨酸。此外,对猪血 Cu·Zn-SOD 进行了胰酶酶解,得具 Cu·Zn-SOD 活性分子片段。

嗜麦芽假单胞菌碱性蛋白酶的纯化及性质研究

嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)27分泌的胞外碱性蛋白酶(经硫酸铵分级盐析、Sephadex G-200和 Sephadex G-75柱层析、聚丙烯酰胺凝胶制备电泳分离得到纯酶。此酶分子量为76000,由两个不同亚基构成(亚基分子量分别为31000和44000)。两条肽链 N 末端氨基酸是 Gly 和 Thr.酶作用最适 pH9.5,最适温度50℃,在40℃以内稳定。以酪蛋白为底物测得其 K_m 值为2.86 mg·ml^(-1)。此酶被 Hg^(2+)抑制,但在 Ca^(2+)、Mg^(2+)、Co^(2+)、Mn^(2+)、Cu^(2+)、Zn^(2+)中有相近活力,4mmol·L^(-1)的 EDTA 可抑制约36%的酶活。用 DFP 和 NBS 修饰对酶有强烈抑制作用,而 PMSF、pCMB、溴乙酸、丁二酮则对酶没有影响。

限制性核酸内切酶Bsp78I的纯化

以Bacillus Sphaericus 78为材料,经亲和层析——高效液相色潜,分离纯化制得电泳纯的限制性核酸内切酶Bsp78I,得率为2020units/g湿菌。所纯化的酶经SDS—PAGE分析为一条带,并测得酶亚基分子量为72 000;经Sephadex G—200凝胶层析测得酶分子量为141 250,说明该酶由两个相同的亚基组成。用Edman降解法和HPLC ULTRASPHERE—PTH柱层析测得Bsp78I酶N—末端氨基酸残基是色氨酸。

限制酶Bsp63 I的化学修饰与抑制动力学研究

经亲和层析得到Ｂｓｐ６３Ｉ．用对氯汞苯甲酸、磷酸吡哆醛、２，３－丁二酮修饰该酶的巯基、赖氨酸、精氨酸残基，结果表明：这些基团均与该酶活性有关．动力学研究表明磷酸吡哆醛对酶的抑制是一种类反竟争性抑制．

限制性内切酶Bsp78I的化学修饰与动力学研究

从Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ７８菌中将Ｂｓｐ７８Ｉ纯化到均一程度．测得该酶对ｐＢＲ３２２ＤＮＡ的Ｋｍ值为２．６７×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１．用对氯汞苯甲酸、磷酸吡哆醛、２，３一丁二酮修饰该酶巯基、赖氨酸、精氨酸残基，结果表明这些基团均与该酶活性有关．