秦川牛Snail1克隆、表达特性分析及其对牛脂肪细胞增殖的作用研究

【目的】肉牛肌内脂肪沉积与牛肉的风味、多汁性和嫩度密切相关。脂肪沉积过程表现为脂肪细胞的增殖(数量增多)和分化(脂质生成),受到了多基因协同调控。前人研究发现,小鼠中Snail1可以参与肌肉发育和脂质稳态调控,但其在牛脂肪生成过程中的作用仍未知,有待进一步研究。【方法】以秦川牛为研究对象,克隆得到Snail1 CDS区序列,构建Snail1时空表达谱,运用生物信息学软件对其功能结构及靶基因进行预测。进一步,通过RNAi干扰结合CCK8、EdU、细胞流式及实时荧光定量PCR等方法探究Snail1对牛脂肪细胞增殖的影响。【结果】秦川牛Snail1与NCBI公布序列相比存在2处碱基同义突变,其在秦川牛新生牛肺、肾周脂肪、小肠呈现较高丰度表达;而在成年牛中,Snail1在肾周脂肪组织中的表达量最高,背最长肌中的表达量次之,肺脏组织中的表达量最低。生物信息学分析发现,Snail1启动子区存在1个651 bp CpG岛及C/EBP、PPARα等与脂肪生成相关的转录因子结合位点。CKⅠ(Ser92/96)、CKⅡ(Ser25/119,Thr89)、CDK1(Ser13/104/112/119/143/183/214/221)、CDK5(Ser105/107)等多个细胞周期相关激酶可能参与了Snail1蛋白的磷酸化修饰。通过对牛已注释基因启动子区提取、靶基因预测及KEGG动态网络构建发现,成脂相关的MAPK、PI3K-Akt、mTOR等信号通路为Snail1参与脂肪生成相关的潜在节点信号通路。进一步,通过RNAi干扰试验对其功能研究表明,Snail1下调促进了牛前体脂肪细胞的增殖,增加了复制期阳性细胞的比例(P<0.01)且促进了G1/S细胞周期转换。RT-qPCR和Western-blot检测表明,干扰Snail1显著上调了促增殖调控基因CCNB1、CCND2、CDK2、CDK4(P<0.05)和蛋白的表达。【结论】Snail1在新生牛肾周脂肪及成年牛肾周脂肪和背最长肌中表达量相对较高。干扰Snail1促进了牛前体脂肪细胞的增殖、G1/S细胞周期转变和CCNB1、CCND2、CDK2、CDK4等增殖相关基因表达;CKⅠ、CKⅡ、CDK1/5等多个细胞周期相关激酶可能通过磷酸化修饰Snail1蛋白进而参与细胞增殖调控,而MAPK、PI3K-Akt、mTOR等为Snail1影响牛脂肪细胞增殖潜在的关键节点通路。研究结果为进一步探究Snail1参与牛脂肪生成作用机制奠定了基础。

Snail1对牛脂肪细胞增殖分化影响及作用机制的研究

旨在探究Snail 1基因对于牛脂肪细胞增殖分化的影响及其潜在的作用分子机制。本研究利用腺病毒在秦川牛脂肪细胞中过表达Snail 1基因并设置试验组和对照组各3个生物学重复,采用流式细胞术、CCK-8、EdU染色、油红O染色、甘油三酯测定、qRT-PCR和蛋白质印迹等试验方法探究Snail 1对牛脂肪细胞增殖和分化的影响;进一步通过RNA-Seq、双荧光素酶报告试验筛选其作用信号通路及靶基因。结果表明,过表达Snail 1抑制了细胞增殖(CCK-8)且减少了处于S复制期阳性细胞比例(EdU,P<0.05)。结合流式细胞术试验,结果表明Snail 1上调导致了细胞周期G1/S期阻滞。进一步的实时荧光定量PCR和蛋白质印迹结果表明,Snail 1抑制了细胞周期蛋白基因CCNB1、CCND 2的表达(P<0.05)。对诱导分化第6天牛脂肪细胞进行油红O染色和甘油三酯检测,结果表明Snail 1抑制了牛脂肪细胞的成脂分化和甘油三酯的生成。qRT-PCR分析表明,过表达Snail 1抑制了PPARγ(P=0.06)、FABP4(P<0.05)、LPL(P<0.05)基因表达,而PIK 3R3基因表达水平显著上调(P<0.01);蛋白质印迹结果表明,Snail 1表达显著抑制了FABP4蛋白表达。进一步通过RNA-Seq测序分析发现,Snail 1过表达引起的差异基因主要富集在PPAR、ECM受体互作、PI3K-AKT、MAPK、尼古丁成瘾及胰岛素分泌等信号通路。基于FIMO靶基因筛选联合RNA-Seq数据分析及荧光素酶试验等证实,转录因子Snail1可能通过靶向Wnt信号通路的拮抗剂SFRP2影响牛脂肪细胞的分化过程。Snail 1基因抑制牛脂肪细胞的增殖和分化过程,且可能通过“Snail1/SFRP2-Wnt/β-catenin-GSK3β”正反馈环参与了牛脂肪细胞分化调控过程。