HPV16 E5多表位肽免疫原性研究

目的筛选人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白多表位肽段,并评估其诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的免疫原性反应。方法通过Uniprot获得HPV16 E5蛋白的氨基酸序列,采用EXPASY和SYFPEITHI等软件预测HPV16 E5蛋白的表位,筛选出富含B细胞和CTL表位的氨基酸肽段——HPV16 E5蛋白N端处aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV),进一步用该多表位肽免疫C57BL/6小鼠,评估其诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫的反应。结果该肽段可诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,且抗体滴度随着免疫次数增加而升高,同时可诱导小鼠产生特异性的CTL反应,在效靶比为40∶1时,对靶细胞产生显著的特异性杀伤作用。结论HPV16 E5蛋白多表位肽aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV)具有良好的免疫原性,可为基于HPV16 E5蛋白的疫苗研究提供基础。

基于NK相关基因的急性髓细胞白血病预后风险评估模型的建立

目的:通过分析NK细胞相关基因(NRGs)在急性髓细胞白血病(AML)中的表达模式及其与预后的关系,构建新型风险评分模型以评估AML患者的预后。方法:基于生物信息学的方法下载TCGA数据库中AML转录组数据。根据NRGs的表达不同,通过无监督聚类将AML患者分组,并分别分析不同亚组AML患者的生存差异、基因功能富集情况和免疫相关分析。根据亚组的差异表达基因,通过Cox生存分析以及LASSO回归分析构建基于NRGs的预后评估模型。最后收集AML患者的骨髓样本进行转录组测序,进一步验证预后评估模型中各基因与AML的相关性。结果:单因素Cox筛选与预后相关的NRGs,并根据其表达情况将AML患者分成3个亚组。生存分析以及富集分析、免疫浸润分析、免疫检查点分析均发现亚组2具有更好的临床预后,并且免疫微环境明显重塑。进一步根据三个亚组的差异表达基因,通过Cox联合LASSO回归分析构建风险评分模型,此风险评分模型与AML的临床预后显著相关。临床病例的转录组测序结果表明,风险模型的6个AML危险基因中,ADGRG1、LSP1、PDE7B在复发患者中的表达量较缓解患者上调,保护基因TBX1的表达量则下调。结论:本研究构建的AML患者风险评分模型可作为一种新的预后评估手段,具有较好的预测价值。

沙眼衣原体Pgp3多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备沙眼衣原体(Ct)Pgp3蛋白的兔多克隆抗体,并检测其生物学功能。方法:采用原核表达系统制备Pgp3蛋白,通过镍柱亲和纯化Pgp3蛋白并进行复性。将复性的Pgp3蛋白经皮下多点注射免疫家兔制备兔多克隆抗体,利用ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性。随后建立Ct感染HeLa细胞模型,通过间接免疫荧光法和非变性Western blot法检测兔多克隆抗体对天然Pgp3蛋白的特异性识别能力。结果:Pgp3重组蛋白成功诱导表达,且主要以包涵体形式存在。ELISA显示制备的兔多克隆抗体效价可达1:512000,Western blot法和间接免疫荧光法显示Pgp3兔多克隆抗体可以特异性识别重组及天然Pgp3蛋白。结论:制备的Pgp3多克隆抗体效价高,能特异性识别重组Pgp3蛋白及天然Pgp3蛋白,为Pgp3蛋白功能的研究及Ct免疫制剂的研发等奠定基础。

新型冠状病毒S蛋白B细胞表位的预测与分析

目的:分析新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S刺突蛋白的二级结构并预测其可能的B细胞表位。方法:基于SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列,分别采用SOPMA、GOR方法预测S蛋白的二级结构,并结合其跨膜区、亲水性、表面可及性和抗原性参数等综合分析,预测SARS-CoV-2 S蛋白可能的B细胞表位。结果:对SARS-CoV-2 S蛋白二级结构的预测表明,其二级结构中柔性区域以无规卷曲为主,少见转角。多种参数综合分析推测,其可能的优势B细胞表位位于354~360、437~445、454~471、527~537、567~582、678~685、772~779和806~818位氨基酸。结论:采用多参数预测SARS-CoV-2 S蛋白的B细胞表位,为深入研究S蛋白的功能奠定基础。

E血清型沙眼衣原体主要外膜蛋白B细胞表位的预测

基于E血清型沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）主要外膜蛋白（Major outer membrane protein，MOMP）氨基酸序列，采用Hopp-Woods的亲水性方案、Emini表面可及性方案、Jameson-Wolf抗原指数方案和Janin可及性方案等，辅以对MOMP蛋白的二级结构中的柔性区域及跨膜区域的分析，预测CTMOMP蛋白的B细胞表位。推测最有可能的B细胞表位位于MOMP蛋白N端第73～81区段、217～225区段、第377～386区段、第261～270区段和第161～175区段内或它们的附近。用多参数预测CTMOMP蛋白的B细胞表位，为进一步研究蛋白特性及表位疫苗研制奠定了基础。

沙眼衣原体主要外膜蛋白生物信息学分析

目的:分析和预测E血清型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)的结构和功能。方法:采用计算机辅助生物软件和网络数据库,从SwissProt蛋白质数据库中检索MOMP氨基酸序列,用Expasy服务器分析预测MOMP蛋白理化性质、二级结构,同时用Pcons服务器分析模拟蛋白质空间结构。结果:分析显示,Ct MOMP蛋白为一跨膜16次的酸性蛋白质,其空间结构为β-桶状膜蛋白,推测其功能为孔蛋白。结论:通过对MOMP生物信息学分析获得该蛋白的特性,为进一步研究Ct的感染与发病机制、研制Ct亚单位疫苗以及研究MOMP新的功能域等提供理论依据。

医学免疫学实验教学改革的初步探索

通过分析传统医学免疫学实验教学和考核的现状和弊端,温州医科大学对医学本科生的免疫学实验课教学内容、教学模式和考核评估等进行了一些改革尝试和探索,以调动学生学习的主动性和积极性、提高医学免疫学实验课的教学效果和质量。

人乳头瘤病毒结构蛋白L1与白色念珠菌甘露糖蛋白CTL表位嵌合基因在昆虫细胞中的表达

目的构建携带人乳头瘤病毒(HPV)结构蛋白L1和白色念珠菌甘露糖蛋白(CaMp65)细胞毒性T细胞表位(CTL)基因的重组质粒,并在杆状病毒-昆虫细胞系统中进行表达。方法分别设计包含HPV6bL1和CaMp65CTL145-153的引物,经PCR扩增嵌合基因HPV6bL1/CaMp65CTL145-153,并进一步将其插入杆状病毒表达载体pFastBacTM1。在E.coliDH10Bac中组装成重组杆状病毒,在昆虫细胞sf-9中表达嵌合蛋白,并经SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定。结果HPV6bL1/CaMp65CTL145-153嵌合蛋白在昆虫细胞sf-9中得到了表达,表达产物的相对分子质量为56000,与HPV6bL1单抗能产生特异性反应。结论HPV6bL1/CaMp65CTL145-153嵌合蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中得到了成功表达,为防治HPV和白色念珠菌感染的基因工程疫苗的研究奠定了基础。

病毒样颗粒疫苗的应用前景

病毒样颗粒为一不含病毒核酸的空壳结构 ,与天然的病毒颗粒结构相似 ,具有很强的免疫原性和生物学活性 ,它在病毒感染的防治和血清学诊断方面具有广阔的应用前景。

医学微生物学选修课的开设与体会

针对医学微生物学学科知识量大,内容繁杂,传统教学中学生学习被动、依赖性强、积极性不高的问题,本教研室开设医学微生物学选修课,改变教学方式,激发学生的学习兴趣;拓宽了学生的知识面,增强了学生的社会责任感和历史使命感。

浅谈如何提高留学生医学免疫学的教学质量

顺应医学教育国际化趋势,温州医学院留学生的医学免疫学全英文教学实践活动进行已有五年。作为一门医学桥梁学科,医学免疫学留学生全英文教学之初也遇到教材、师资、授课方法等诸多困难。该文通过对留学生医学免疫学的教学实践,探讨在留学生医学免疫学全英语教学过程中存在的普遍问题及其解决方法,以期为今后的留学生教学提供借鉴。

研究生免疫学实验技术课程的开展与体会

免疫学实验技术课程是医学研究生教学中一门应用性很强的基础课。根据温州医学院研究生教学课程的情况,笔者就课程的设置,如何加强实验课教学,怎样培养学生动手能力和科研创新意识,以及培养学生逻辑思维能力和口头表达能力等方面的教学经验进行了总结。

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。

温州地方株HPV16型L1基因多态性及蛋白特性分析

目的:了解温州地方株HPV16 L1基因结构特点,分析其结构蛋白L1基因多态性及蛋白特性变化,为基于L1基因工程疫苗的设计和应用提供理论依据。方法:设计HPV16型L1基因特异性引物,从宫颈癌组织标本提取DNA,进行PCR扩增鉴定,PCR产物直接测序;进一步用Vector NTI 8.0和DNAStar软件分析HPV16型L1基因多态性及蛋白特性变化情况。结果:测定的序列与标准基因序列(NC 001526)比较,温州地区宫颈癌感染的HPV16型L1基因同源性为99.1%～99.8%,分别形成8种突变模式,其中3处由于核苷酸的改变,翻译的氨基酸也相应发生变化,但其编码蛋白在亲水性、表面可及性及抗原性上与标准株相比较无明显变化。结论:温州地方株HPV16 L1核酸有一定程度的变异。

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1重组嵌合抗原免疫血清的制备与鉴定

目的制备与鉴定弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)重组嵌合抗原的特异性免疫兔血清。方法将已构建的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,分离上清液和包涵体,包涵体用2mol/L和4mol/L尿素梯度洗涤去杂蛋白,最后用8mol/L尿素溶解洗涤后的包涵体,进行十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),割胶回收目的蛋白,研磨成乳浊状后以背部多点注射免疫大白耳兔,制备免疫兔血清,以免疫扩散试验检测生成的特异性抗体,间接ELISA法测定免疫血清的抗体效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析免疫血清的抗体特异性。结果免疫结束后,通过对流免疫扩散试验检测到了针对rROP2-P30的特异性抗体,间接ELISA法测定到其抗体滴度最高可达1∶12800,Western blotting分析结果表明,此免疫血清与可溶性的重组蛋白、包涵体形式的重组蛋白均能特异性结合。结论得到了针对rROP2-P30重组嵌合抗原的特异性免疫血清。

EB病毒潜伏膜蛋白2的二级结构分析和B细胞表位预测

目的:预测EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)的二级结构和B细胞表位。方法:以EBV标准株(B95.8)LMP2的完整氨基酸序列为基础,采用SOPMA、GOR、nnPredict和HNN四种方法分别预测LMP2的二级结构;并结合其跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、极性和柔韧性等进行综合分析,预测EBV LMP2的B细胞优势表位。结果:四种方法对EBVLMP2二级结构的预测均表明,其二级结构中柔性区域以无规卷曲为主,少见转角。B细胞优势表位可能位于其N端199～209、318～322和381～391区段。结论:用多参数预测EBV LMP2的二级结构和B细胞优势表位,可为其单克隆抗体的制备和表位疫苗设计等研究提供理论依据。

肿瘤相关抗原CEA的B细胞表位预测

目的分析癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的B细胞表位,为肿瘤治疗提供理论基础。方法以CEA的完整氨基酸序列为研究基础,采用Hopp&Woods的亲水性方案,Emini表面可及性方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以CEA的二级结构及其柔性区域分析,预测CEA的B细胞表位。结果预测的B细胞表位可能位于CEA的N端第150￣160、168￣172、207￣211、332￣338、372￣377、467￣472、485￣490、507￣516、580￣584区段。结论应用多参数预测CEA的B细胞表位,可进一步用于CEA相关肿瘤治疗性表位疫苗的分子设计和研究。

人类表皮生长因子受体2的B细胞表位初步预测分析

目的预测人类表皮生长因子受体2(HER2/neu)的B细胞表位,为肿瘤免疫治疗提供理论基础。方法以生物信息学软件综合预测筛选HER2/neu可能B细胞表位,以吴氏平均抗原性指数为标准,确定目的表位。结果HER2/neu为一跨膜蛋白,其二级结构中以无规则卷曲的区域出现较多。其N端第497～504,939～943,1 106～1 116,1 140～1 158,1 166～1 175,1 225～1 234,1 240～1 246区段,可能为HER2/neu的优势B细胞表位。结论应用多参数预测HER2/neu的B细胞表位,可进一步为HER2/neu相关肿瘤治疗性表位疫苗分子设计和研究提供理论依据。

EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究

目的:制备高效价EB病毒膜蛋白抗体,并对其效价及其与EBV结合的特异性进行鉴定。方法:将B95-8细胞培养至3×105/mL时,超声破碎,纯化获得EB病毒膜蛋白抗原;EB病毒膜蛋白抗原经弗氏佐剂乳化,在家兔背部皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共3次,并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清,检测兔免疫血清抗体IgG;进一步采用Western blot检测制备的血清抗体与EBV结合的特异性,同时采用ELISA法检测兔血清抗体水平及各周抗体滴度的变化趋势。结果:所有家兔在全程免疫后都产生了高效价膜蛋白的特异性抗体,最高滴度达1:6400。结论:用B95-8细胞制备的EB病毒膜蛋白抗原免疫家兔,可成功制备高效价的特异性血清抗体,为EB病毒膜蛋白抗原的免疫学检测奠定了基础。

E血清型沙眼衣原体抗体的制备及检测

目的:制备高效价E血清型沙眼衣原体(CT)的多克隆抗体。方法:用hep-2细胞培养制备并用超速离心方法纯化E血清型CT作为抗原,采用弗氏佐剂乳化抗原,背部皮下多点免疫4只家兔,收获免疫后血清制备多克隆抗体,用Western blot方法进行鉴定,ELISA法检测抗体水平。结果:所有家兔在全程免疫后都产生了高效价的血清抗体,最高滴度达1:1600。Western blot实验结果显示,本研究制备的CT血清抗体能与CT全菌体抗原发生特异结合。结论:CT菌体抗原免疫家兔可成功制备高效价的血清抗体,为建立沙眼衣原体免疫检测方法打下了基础。