局部肾素血管紧张素系统在心肌细胞氧反常中的作用

利用成年大鼠分离的心肌细胞氧反常模型,用新一代钙荧光探针(Fluo-3)检测细胞内游离钙浓度。对比观察了血管紧张素Ⅱ及转换酶抑制剂(巯甲丙脯酸)对钙超载的影响。结果表明前者促成钙超载的形成,而后者可以防止钙超载。从而证明心肌细胞的肾素血管紧张素系统在氧反常时细胞钙超载中具有重要作用。

vWF-△Pro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FⅧ基因转移

多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除.前肽缺失突变体vWF(vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白.为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响,将vWF-ΔPro基因和融合SspDnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达,用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式,并检测了其对FⅧ的结合力;用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ,并用Coatest法检测由其产生的生物活性.结果显示,vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式,其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近;vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21ng/mL,活性为1.78±0.18IU/mL,明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12ng/mL和1.05±0.13IU/mL),与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19ng/mL和1.95±0.22IU/mL),表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性.为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据.

酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子Ⅷ转基因表达

最近的研究表明,蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌,而且剪接反应在细胞内、外均可发生.为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效,将具有促进重链分泌作用的位于Pro1640～Ser1690的酸性区3(acidic region-3,AR-3)引入重链,检验对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响.用融合蛋白内含子的附加ar-3重链(HCAR3IntN)基因和轻链(IntCLC)基因共转染培养的HEK293细胞,分别用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性,并用免疫印迹观察了细胞内的BDD-FⅧ剪接.结果显示,共转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞,分泌至上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性分别为(173±26)μg/L和(1.31±0.15)U/ml,明显高于未添加ar-3的蛋白质内含子融合重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)基因共转染细胞[(102±12)μg/L和(0.79±0.09)U/ml],提示AR-3对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性有明显改善作用.而且,分别转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中,亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和活性[(35±7)μg/L和(0.28±0.08)U/ml],表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接.另外,转基因细胞总蛋白呈现明显的可与FⅧ多克隆抗体进行反应的剪接BDD-FⅧ蛋白条带,直观地反映细胞内BDD-FⅧ的剪接.为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术的双腺相关病毒载体(AAV)转BDD-FⅧ基因实验提供了依据.

内含肽介导的氯离子通道蛋白CFTR的反式剪接

研究利用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能在大肠杆菌中对囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)的反式剪接作用.CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病囊性纤维化(cystic fibrosis,CF).将CFTR的cDNA于剪接反应所需的保守性氨基酸残基Ser660前断裂为N端和C端,分别与split mini Ssp DnaB内含肽的106个氨基酸残基的N端和48个氨基酸残基的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pBV220.诱导表达后SDS-PAGE可见预期大小剪接形成的CFTR蛋白条带,Western印迹用CFTR特异性抗体进一步证明为剪接所产生的CFTR蛋白,表明内含肽可有效催化CFTR的反式剪接.

二硫键形成促进双载体转断裂B区缺失型凝血因子Ⅷ基因

双载体共转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)重链和轻链基因是克服腺相关病毒载体(AAV)容量限制的一种策略,但重链分泌的低效性产生链不均衡性,影响转基因的功效.假设重、轻链链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,本文将BDD-FⅧ的重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys.双载体培养的COS-7细胞共转染突变重链和轻链基因,Western blot显示细胞内二硫键交联的重、轻链蛋白形成,ELISA和Coatest分析细胞培养上清的BDD-FⅧ重链分泌量和生物活性,分别为(109±13)μg/L和(0.65±0.12)U/ml,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞((71±11)μg/L和(0.35±0.05)U/ml).结果表明,链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,为进一步动物体内运用双AAV载体转BDD-FⅧ基因提供了实验依据.

内含肽介导三段vWF基因真核细胞转移的翻译后连接及其功能性多聚体形成

vWF(von Willebrand factor)是一种超大分子质量的血浆多聚体糖蛋白,在血栓形成和生理凝血过程中发挥重要作用,其质和/或量的缺陷导致血管性血友病(VWD),由于VWD为单基因病,且vWF为分泌性蛋白,基于基因转移的基因治疗无需特异的靶器官,因此VWD特别适合于基因治疗,但vWF基因过大(8.4 kb),难以为多数病毒载体特别是优点较多的腺相关病毒(AAV)载体承载.运用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能,研究了三重载体真核细胞共转断裂3段的vWF基因,以期通过转基因翻译后的蛋白质剪接作用形成完整的功能性vWF蛋白.将vWF的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段,分别与2种不同的内含肽即Ssp DnaE内含肽和Ssp DnaB内含肽编码序列融合,构建到真核表达载体pcDNA3.1(+),得到3个分别融合内含肽的vWF片段基因真核表达载体,共转染培养的293细胞,通过瞬时表达,电泳观察培养上清中的vWF多聚体形态,分析vWF蛋白量和凝血Ⅷ因子(FⅧ)结合力;通过共转FⅧ基因,分析了培养上清中的FⅧ蛋白量及生物活性.结果显示,通过内含肽的蛋白质反式剪接作用,共转内含肽融合的三片段vWF基因细胞上清,表现与正常人血浆和转vWF基因阳性对照细胞相似的vWF多聚体模式和FⅧ结合力,而且可明显提高转FⅧ基因后表达的FⅧ蛋白的分泌量和活性,提示剪接vWF蛋白的FⅧ载体功能的恢复.结果表明,内含肽可作为一种有效的技术手段进行三重载体共转断裂的vWF基因,为进一步基于内含肽的三重AAV转断裂vWF基因应用于VWD基因治疗研究、克服AAV的容量限制提供了依据.

双Intein介导3片段vWF的反式剪接

von Willebrand因子(vWF)基因突变导致血管性血友病(VWD),由于其基因过大在基因治疗研究中难以为多数病毒载体携带.利用双内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能研究断裂成3段的vWF基因分别表达后在蛋白水平的连接,旨在为vWF基因的3载体联合转移应用于VWD基因治疗研究提供依据.将vWF cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段(N、M和C),分别与splitSspDnaE intein的N端(En)、C端(Ec)和splitSspDnaB intein的N端(Bn)、C端(Bc)编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)中的His-Tag的下游,得到3种表达载体pET-NEn、pET-EcMBn和pET-BcC.分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE分析融合蛋白的表达,并进一步用His-Tag的特异性抗体进行分析;亲和层析纯化分别表达的带His-Tag标签的3段蛋白,复性后体外混合进行剪接实验以观察3片段vWF的连接.结果显示,3段预期大小的融合intein的vWF蛋白均有表达,用His-Tag抗体进行的Western印迹得到进一步证实;3段纯化的蛋白混合后可见明显的剪接条带形成,与vWF的预期分子量大小一致,表明双intein通过蛋白质反式剪接可有效连接3个片段的vWF,为进一步应用蛋白质剪接技术的3重载体真核细胞转vWF基因奠定了基础.

RNAi介导的Bip表达下调促进基于蛋白质剪接的双链共转基因细胞分泌FⅤⅢ凝血活性

目的探讨用RNA干扰技术下调内质网蛋白伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的表达,对基于蛋白质剪接的双链共转凝血因子ⅤⅢ(FⅤⅢ)基因HEK293细胞分泌剪接FⅤⅢ蛋白的量和活性的影响。方法以培养的HEK293细胞,用含蛋白内含子的B区缺失型FⅤⅢ(BDD-FⅤⅢ)的重链和轻链基因表达载体共转染经Bip-siRNA处理的细胞,免疫印迹法检测Bip的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长,用酶联免疫吸附(ELISA)和发色分析法分析转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅤⅢ蛋白量和活性。结果 RNA干扰下调Bip表达作用明显,细胞生长不受影响;Bip下调的共转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅤⅢ和重链量分别为(142±33)μg/L和(197±43)μg/L,明显高于对照细胞[分别为(89±23)μg/L和(120±27)μg/L];Bip下调的共转基因细胞分泌的FⅤⅢ凝血活性为(1 050±160)IU/L,明显高于对照细胞[640±170(IU/L)]。结论 Bip表达下调通过促进剪接BDD-FⅤⅢ的分泌可有效提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅤⅢ基因功效,为进一步动物体内实验提供了依据。

Met662和Asp1828的Cys突变增强蛋白内含子对共表达的BDD-FVⅢ重链和轻链的剪接

本文旨在通过B区缺失型凝血因子8(BDD-FVⅢ)重、轻链间二硫键形成,改善蛋白质反式剪接效率,提高双载体转BDD-FVⅢ基因功效.将BDD-FVⅢ重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys,用蛋白内含子融合的重链和轻链基因共转染HEK293细胞,Western印迹检测到细胞内BDD-FVⅢ剪接量的提高以及重、轻链间二硫键的形成,用ELISA和Coatest测得细胞分泌至培养上清的剪接BDD-FVⅢ的量(119±14 ng/mL)和活性(1.06±0.08 IU/mL),明显高于野生型BDD-FVⅢ重链和轻链基因共转染细胞的量(81±12 ng/mL)和活性(0.70±0.15 IU/mL);混合培养的转突变重链和轻链基因细胞培养基中剪接BDD-FVⅢ的量(17±5 ng/mL)和活性(0.15±0.03 IU/mL),与混合培养的转野生型重链和轻链基因细胞(分别为21±9 ng/mL和0.18±0.05IU/mL)相近,反映不依赖细胞机制的蛋白质反式剪接.结果表明,重、轻链间二硫键形成通过增强蛋白质反式剪接提高双载体转BDD-FVⅢ基因的功效.为进一步运用双AAV载体动物体内转BDD-FVⅢ基因提供了实验依据.

内膜剥脱血管转染尿激酶原基因重组复制缺陷型腺病毒载体对新生内膜增生影响的研究

应用尿激酶原（ｐｒｏＵＫ）基因重组复制缺陷型腺病毒载体，防治家兔髂动脉内膜剥脱后新生内膜的增生。结果显示：导入ｐｒｏＵＫ基因三周后，血管组织内ｐｒｏＵＫ基因的ｍＲ－ＮＡ及其表达产物明显高于导入野生型腺病毒对照组；血管造影及切片显示血管狭窄程度较轻，新生内膜与中膜面积比（Ｉ／Ｍ）明显低于对照组。提示：血管内膜剥脱后导入ｐｒｏＵＫ基因，通过对抗血管内膜损伤后的血栓形成和血小板的沉积，从而抑制由血栓及血小板促发的新生内膜过度增生，具有潜在的应用价值。

RGD肽与尿激酶B链融合蛋白原核重组表达质粒的构建、表达和功能的初步分析

将化学合成的RGD肽 (Arg Gly Asp)编码寡核苷酸与尿激酶B链cDNA相连成为融合基因后 ,克隆至原核表达质粒pBV2 2 0中 ,在PRPL 启动子的作用下 ,经 42℃热诱导 ,在大肠杆菌DH5α中获得了融合基因的表达 ,其表达量占菌体总蛋白的 9 2 % ,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到纯化的融合基因的表达产物 ,经Westernblotting分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性 ,体外活性分析显示其具有一定的纤溶和抗血小板聚集的活性。

基于高素质应用型人才培养的生物化学教学

生物技术专业肩负着高素质应用型人才培养的重任。作为本专业最重要的专业基础课程,同时也是生命科学的共同语言,生物化学致力于分子水平理解生命现象的本质,是生命科学转化为生物技术的基础和支撑。因此,生物化学教学在以应用型人才培养为主要使命的生物技术专业建设和发展中突显其重要性。在生物化学教学中,我们积极探索教学改革,坚持以人为本、与时俱进,用科学发展观统领教学,突出基础知识体系进行形象化教学、开展互动式和讨论式教学,变学生的被动上课为主动听课,引入生命科学的前沿知识,进行双语教学,注重实验课教学和科研训练,培养学生的科学思维和应用知识的能力,关心学生成长,教书育人。

基于科学发展历程和前沿进展的生物化学双语教学实践

生命科学发展迅速,越来越深入、细致的生命科学研究,不断涌现新的概念、机制和途径等知识,呈现出信息化、大数据的时代特征。生物化学作为生命科学的基本语言和基石,引领生命科学的发展方向。因此生物化学教学在生命科学各专业教学中具有特殊重要的地位。如何在生命科学迅猛发展的新形势下培养既有深入扎实的基础知识又对科学前沿知识具有良好认识、具有与时俱进科学素养的合格人才,生物化学教学责无旁贷、责任重大。在生化教学中,注重基础知识体系教学的同时,我们探索了将生物化学相关的发展历程和重要科学前沿知识的信息融入教学,积极开展和推进双语教学,用科学化、信息化和专业的语言培养和激发学生的学习兴趣和对生命科学的热爱,有力地推动了生化教学改革。

亮氨酸拉链提高小鼠血浆中剪接的凝血因子Ⅷ凝血活性

培养细胞实验表明,亮氨酸拉链通过改善内含肽(intein)的蛋白质剪接效率,提高双载体转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)基因细胞剪接FⅧ蛋白的分泌量和活性.本文从C57BL/6小鼠门静脉注射含亮氨酸拉链和Ssp DnaB内含肽融合的BDD-FⅧ的重链和轻链基因双表达载体,48 h后,检测到血浆的重链分泌量和FⅧ活性分别为(298±67)μg/L和(1.15±0.29)U/mL,明显高于不含亮氨酸拉链的双载体转BDD-FⅧ基因对照小鼠((179±59)μg/L和(0.58±0.19)U/mL).结果表明,亮氨酸拉链通过改善蛋白质反式剪接,提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅧ基因小鼠血浆的凝血活性,为进一步双腺相关病毒(AAV)载体转BDD-FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了依据.

BiP表达下调改善双载体转断裂FⅧ基因的功效

双载体转凝血Ⅷ因子(FⅧ)基因可作为一种转基因策略克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但重链分泌的低效性影响转基因功效.为提高重链分泌,本文用RNA干扰技术下调内质网内蛋白伴侣分子免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)的表达,观察对HEK293细胞双载体共转FⅧ基因分泌重链和生物活性的影响.结果显示,RNA干扰可明显下调BiP表达,但不影响细胞生长;ELISA检测BiP下调细胞单独转重链基因时的重链分泌量为98±38 ng/mL,与轻链共转基因时显著升高到157±32 ng/mL,明显高于对照细胞单独转重链基因和共转重链和轻链基因的重链分泌量(分别为29±8 ng/mL和79±19 ng/mL);Cotest法检测显示,BiP下调细胞共转重链和轻链基因细胞分泌的凝血生物活性为0.73±0.23 IU/mL,明显高于对照细胞共转重链和轻链基因(0.39±0.07 IU/mL).结果表明,BiP表达下调通过促进重链分泌,可提高双载体共转FⅧ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了实验依据.

基于蛋白质剪接的BHK细胞Ser^(660)前断裂的CFTR基因转移

利用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接技术,研究双载体真核细胞转囊性纤维化跨膜电导调节体(CFTR)基因,通过翻译后连接成为完整的功能性CFTR蛋白.应用基因重组技术,将人CFTRcDNA于剪接反应所需保守残基Ser660前断裂为N端和C端两部分,分别与split Ssp DnaB intein编码序列融合,构建到真核表达载体pEGFP-N1和pEYFP-N1.用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞(BHK),48h后Western印迹观察CFTR蛋白质的连接,并用全细胞和单通道膜片钳技术记录Cl-通道电流.基因共转染细胞可观察到明显的由蛋白质反式剪接形成的完整CFTR蛋白,膜片钳记录到较高的全细胞Cl-电流和与转野生型CFTR基因细胞相似的单Cl-通道开放活性,提示CFTR功能的恢复.内含肽可作为一种技术策略用于双载体转CFTR基因,为应用双腺相关病毒载体(AAV)转基因的囊性纤维化疾病(CF)基因治疗提供了依据.

人尿激酶受体cDNA的克隆及序列测定

以高转移性人肺巨细胞癌细胞系PG的总RNA为模板 ,用RT -PCR方法扩增人尿激酶受体 (uPAR)的cDNA。将其亚克隆至pGEM -T载体后进行测序 ,结果表明 ,我们所克隆的uPARcDNA片段与文献报道的人uP AR基因编码区cDNA序列高度同源 (达 99% ) ,其中第 70 5、746和 75 5碱基分别由A、A和G替代了文献中的T、G和A ,从而导致了第 2 49和 2 5 2位氨基酸由Gly和Glu变为Asp和Gly ,我们已将此序列申请登录GenBank ,登录号为AF2 5 7789。

丹参对家兔实验性动脉粥样硬化预防作用的研究

丹参预防组主动脉斑块面积占主动脉总面积的百分比为（１９．８５±１１．７９％），明显小于动脉粥样硬化（ＡＳ）模型组（３７．７９±１０．８０％），Ｐ＜０．０５。丹参有显著保护超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性和清除脂质过氧化物中间产物丙二醛（ＭＤＡ）的作用。丹参能明显抑制在高脂条件下３Ｈ－ＴｄＲ掺入培养的平滑肌（ＳＭＣ），抑制ＳＭＣ、ＤＮＡ合成。本研究初步探讨了丹参抑制家兔实验性ＡＳ病变发生发展的作用机制。

低强度He－Ne激光照射对缺氧／再给氧心肌细胞内钙的影响

本文以离体大鼠心肌细胞作为缺血／再灌注损伤的《氧反常》模型。为测定低强度Ｈｅ－Ｎｅ激光照射前、照射后心肌细胞内游离钙浓度（［Ｃａ￣（２＋）］ｉ）变化，我们应用了最新一代钙荧光探针（Ｆｌｕｏ－３），结果表明：（１）缺氧／再给氧组和激光照射前、后组心肌细胞［Ｃａ￣（２＋）］ｉ明显高于正常对照组。（２）缺氧／冉给氧织心肌细胞［Ｃａ￣（２＋）］ｉ明显高于激光照射前、后组，但是激光照射前与照射后心肌细胞［Ｃａ￣（２＋）］ｉ没有明显变化。同时我们分别观察了各组心肌细胞超微结构变化。我们的研究表明Ｈｅ－Ｎｅ激光照射对缺氧／再给氧损伤有预防和治疗作用。