红花Aux/IAA基因家族鉴定及盐胁迫响应分析

为了对红花Aux/IAA基因家族进行生物信息学分析,研究该基因在红花生长发育中的调控作用,利用生物信息学方法,在红花全基因组中鉴定出28个Aux/IAA基因。根据其与拟南芥Aux/IAA基因的系统发育关系,使用MEGA 7.0做出系统发育进化树。经理化性质分析,红花Aux/IAA蛋白为亲水性蛋白,且79%位于细胞核中,大多数红花Aux/IAA蛋白表现为偏酸性;经聚类分析,将红花Aux/IAA基因分为5个亚族。基因结构分析表明,所有基因均含有1~9个内含子。这些基因在红花的9条染色体上非均匀地分布,其中9号染色体上分布最多,有7个Aux/IAA基因。红花Aux/IAA基因在不同发育期及不同外源激素处理下表达量各不相同。对保守基序作图分析发现,大部分红花Aux/IAA蛋白具有4个共同的保守基序,分别为motif 1、motif 2、motif 3、motif 4,qRT-PCR结果表明,不同浓度盐胁迫处理24 h后,基因CtAux/IAA1相对表达量呈上调趋势,推测此基因可能与提高红花抗盐胁迫能力有关。本研究结果将有助于了解红花Aux/IAA基因家族在生长发育过程中的功能并筛选优良基因。

红花CDPK基因家族的鉴定及表达分析

钙依赖性蛋白激酶(CDPK)是植物细胞内Ca2+信号识别及转导的重要媒介,在植物的生长发育以及逆境响应过程中起着重要的作用。本研究通过多种生物信息学的方法和手段,对鉴定出来的30个CDPK基因进行分析鉴定,结果显示30个CtCDPK基因所编码的氨基酸分子量为47781.96~93251.66 ku,等电点为5.09~9.27;基因结构预测结果表明,所有CtCDPK基因均含有6~13个外显子;染色体定位结果表明,30个CtCDPK基因分别定位在10条染色体上,其中8号染色体上最多,有5个,2号、4号染色体上没有;系统发育树分析结果显示将其分为6个亚家族;表达分析结果表明CtCDPK基因在不同组织、不同发育阶段中表达模式有所差异。

地黄GGPPS1基因克隆及表达分析

以地黄为材料,通过分析地黄转录组数据,设计特异性引物,克隆了地黄牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因的cDNA序列,命名为RgGGPPS1,GenBank登录号为KU258808。同时在生物信息学分析的基础上,进行原核表达、纯化以及组织特异性表达分析。结果显示:(1)RgGGPPS1基因开放阅读框为987bp,编码328个氨基酸。(2)生物信息学分析结果显示,RgGGPPS1蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD),与芝麻等双子叶植物中的GGPPS蛋白相似性较高。(3)利用构建的原核表达载体pET-32a-RgGGPPS1在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达RgGGPPS1重组蛋白,采用Ni 2+亲和层析得到了纯化的RgGGPPS1重组蛋白。(4)荧光定量PCR结果显示,RgGGPPS1基因在根中表达量最高,叶、茎中表达量较低。研究结果为进一步研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷生物合成途径中的功能奠定了基础。

冬凌草AACT基因的克隆与表达分析

目的:克隆冬凌草乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)基因并分析其在冬凌草不同组织中的表达模式。方法:在冬凌草转录组测序的基础上设计特异引物,采用逆转录PCR技术克隆冬凌草IrAACT基因全长,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR法分析其组织表达模式。结果:克隆得到的IrAACT基因全长1 254 bp,编码417个氨基酸,该序列与丹参等植物中的AACT基因有较高的同源性。生物信息学预测IrAACT具有Ⅱ型硫解酶催化作用的活性中心结构域。实时荧光定量PCR表明,IrAACT在冬凌草花和叶中的表达量明显高于根、茎和愈伤组织。结论:该研究获得了IrAACT基因的全长cDNA序列,并揭示了其在不同组织中的表达差异,为进一步阐述该基因在冬凌草二萜类成分合成途径中的功能奠定了基础。

冬凌草1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆与表达分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)是植物萜类代谢通路中2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径的第一个关键酶,在植物萜类物质的生物合成中发挥重要的作用。为了研究该基因在冬凌草二萜类成分合成中的作用,该研究在冬凌草转录组测序结果的基础上设计一对特异性引物,采用RT-PCR方法得到冬凌草Ir DXS基因c DNA全长序列,并对其蛋白进行理化性质分析、信号肽预测、亚细胞定位预测、蛋白质二级结构、三级结构预测分析及跨膜域分析等生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR的方法检测Ir DXS基因在冬凌草不同部位中的表达情况。结果表明:从冬凌草叶片中分离得到了一条编码DXS的全长基因,通过生物信息学软件分析发现,该基因编码全长2 169 bp,编码722个氨基酸,分子量为77.7 k D。多序列比对发现该基因编码的蛋白和其他植物中已知的DXS蛋白序列具有较高的同源性,N端均包含了一段质体转运肽序列,并均具有一个保守的焦磷酸硫胺素结构域和与吡啶结合相关的DRAG结构域。序列进化树分析显示,Ir DXS基因属于植物DXS2家族。DXS基因在冬凌草根中表达量最高、愈伤组织中最低。该研究首次获得了Ir DXS基因的全长c DNA序列,并揭示了其在不同组织中的表达差异,为后续的深入研究Ir DXS基因在冬凌草二萜类成分合成途径中的功能奠定了基础。

植物细胞壁蛋白质提取方法的改进

以玉米黄化苗的中胚轴为材料,利用盐分级分离细胞壁蛋白质.主要做了2点改进:1)利用超声波破碎植物组织细胞;2)增加苯酚抽提步骤除去可溶性细胞质蛋白、细胞壁蛋白质的回收及脱盐.整个过程不涉及过柱层析和透析步骤,因而缩短了提取时间,提高了细胞壁蛋白质的产率.

地黄糖基转移酶基因克隆表达及表达分析

目的:从地黄中克隆尿苷二磷酸糖基转移酶(uridine diphosphate glycosyltransferase,UGT)基因,构建其原核表达体系,为后续分析验证其功能奠定基础。方法:在转录组测序的基础上,通过RT-PCR克隆全长cDNA序列。运用生物信息学的方法对该序列进行分析。通过荧光定量PCR检测该基因在不同品种地黄不同部位中的表达情况。构建重组表达载体pET-32a-RgUGT,并转化大肠杆菌BL21,获得重组蛋白。结果:克隆得到RgUGT基因长度为1 374 bp,编码457个氨基酸,RgUGT基因具有尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶PSPG盒子,荧光定量PCR结果显示RgUGT基因在根和叶中的表达水平较高。该基因成功在大肠杆菌BL21细胞中表达。结论:该研究从地黄中克隆获得了糖基转移酶基因,可为进一步研究其在地黄次生代谢生物合成中的功能奠定基础。

胖大海胶对鲜湿面流变学特性及蒸煮品质的影响

以胖大海胶(胖大海的中层皮层吸水胀润后形成的胶状物)为对象,将胖大海胶以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%(质量分数)的比例添加到面粉中,研究胖大海胶对面团热机械学特性、面粉糊化特性、鲜湿面质构特性、色泽以及蒸煮损失等品质的影响。结果表明,面粉中适量添加胖大海胶可增强淀粉糊化热稳定性,延缓淀粉老化速率;胖大海胶的添加可显著提高鲜湿面吸水率,使鲜湿面蒸煮损失率显著降低,改善鲜湿面滑口感;色泽方面,胖大海的添加使鲜湿面亮度减弱,但具有咖啡色色泽。综合考虑,当胖大海胶添加量在0.4%~0.6%时,鲜湿面的整体品质较为理想。

连翘2个DIR基因的分子特征与表达分析

目的:克隆连翘DIR基因并分析其分子特征和表达特性。方法:克隆两条连翘的DIR基因全长序列,并采用实时荧光定量PCR法对该基因在连翘不同组织以及茉莉酸甲酯诱导下的表达进行分析。结果:克隆得到两个DIR基因(FsDIR1,MF168408;FsDIR2,MF168409),长度分别为558 bp和564 bp,编码氨基酸数目分别为185和187;系统进化树分析表明,FsDIR1属于DIR-a亚家族,FsDIR2属于DIR-b/d亚家族。连翘不同组织实时荧光定量PCR结果表明FsDIR1和FsDIR2在花瓣中表达量最低,而在雌蕊中最高。茉莉酸甲酯诱导后,叶片中连翘苷和连翘酯苷A含量升高,但FsDIR1和FsDIR2的表达量均显著下降。结论:本研究克隆了两个连翘DIR基因,为研究DIR基因在连翘木脂素类化合物生物合成及参与植物的抗性反应中的功能奠定了基础。

新疆引种芍药根不同部位芍药苷及苯甲酸分布规律研究

目的:研究芍药根不同部位的芍药苷与苯甲酸的分布规律,探讨传统的煮制去皮加工工艺对这两个化学成分的影响,为新疆地区芍药的加工与应用提供一定的科学基础。方法:采用HPLC法对煮制前后芍药根的皮层(栓皮)、中层(形成层环外部)、内层(形成层环及其内部)以及不同年限的芍药根不同加工处理方法芍药苷及苯甲酸的含量进行测定。结果:芍药根不同部位芍药苷及苯甲酸的分布规律为,芍药苷:皮层<中层<内层,煮制前后分布规律相同;苯甲酸则是煮制前为中层分布最少,煮制后中层分布最多。未去栓皮者芍药苷含量显著高于去栓皮者,未煮制者苯甲酸含量显著高于煮制者。结论:芍药的加工可以考虑经过煮制后,不去栓皮,以避免芍药苷流失。

夏枯草PvDXS基因的克隆和表达分析

该研究在夏枯草转录组测序的基础上设计特异引物,采用逆转录PCR技术获得该基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR法分析PvDXS在夏枯草不同组织及不同外源性物质诱导下的表达量。结果表明:克隆得到的PvDXS基因开放阅读框2181 bp,编码726个氨基酸,理论分子量为78040.47 D,等电点为6.75,PvDXS蛋白具有Transketolase_C结构域和Transket_pyr结构域,系统进化树结果表明,PvDXS蛋白与丹参、长春花的DXS(SmDXS2、CrDXS2)亲缘关系较近,推测PvDXS属于第Ⅱ类DXS蛋白。qRT-PCR分析表明,PvDXS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA 3处理组该基因表达量升高,其他6种外源性物质处理后表达量均降低,其中CaCl 2、SNP、SA处理后该基因的表达量显著降低。PvDXS基因在不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达。这为进一步研究PvDXS基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。

地黄促生内生尖孢镰刀菌GG22基因组结构分析

通过高通量测序分析1株能够促进地黄生长及次生代谢产物积累的内生尖孢镰刀菌的基因组结构,推测其内生及促生机制。使用Illumina Hiseq X ten双端测序技术对内生真菌GG22进行基因组测序,并进行生物信息学分析。分析结果,共得到17 296个预测的基因,其中基因的总长度26 937 813 bp,平均基因长度为1 557.4 bp。与KOG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr及Pfam常用功能数据库进行BLAST比对,共有17 202个基因得到功能注释,注释率为99.46%,其中有3 801个基因注释到KEGG数据库中;7 431个基因注释到KOG数据库中;11 548个基因注释到Pfam数据库中;9 007个基因注释到Swissprot数据库中;17 201个基因注释到TrEMBL数据库中,且分别有881、5 247、158个基因被注释到CAZyme、PHI、TCDB数据库。基因功能分类分析发现,尖孢镰刀菌GG22的细胞运动和细胞外结构不发达,这可能是其成为地黄块根寄生内生菌的原因之一。基因簇分析得出,GG22可能能够产生碧卡维林等化合物而抑制其他微生物的生长,同时保护寄主植物免受其他病原菌的侵害,成为地黄促生内生真菌。通过对GG22基因组结构进行分析,初步获得了其内生性生物学基础,为进一步阐明其促进地黄生长及次生代谢产物积累奠定了基础。

外源MeJA对高温胁迫下半夏抗氧化系统和胁迫基因的影响

研究叶面喷施外源MeJA对高温胁迫下半夏的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的影响;对脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性糖含量及有效成分含量的影响;对小分子热激蛋白(sHSP)等胁迫相关基因表达的影响。将生长状况一致的半夏植株在40℃高温下进行胁迫处理,实验组喷施50μmol·L^-1的外源MeJA溶液,空白组喷施等量的水,分别在处理2、6、12、24、48 h时进行取样,对样品进行指标测定。结果发现,在40℃高温下,喷施一定浓度的外源MeJA可以提高半夏叶片的SOD、POD、APX活性,降低MDA质量分数,增加脯氨酸及可溶性糖含量;对半夏有机酸含量无明显影响。2个细胞质型小分子热激蛋白和GRRBP蛋白,在MeJA处理后表达量显著增加。由此得出结论:喷施外源MeJA可以增强半夏中部分抗氧化酶的活性,保护半夏的细胞膜,增强细胞的渗透调节能力,且外源MeJA可能增加半夏高温胁迫响应基因的表达。

内生真菌GG22诱导子对地黄毛状根生长和次生代谢的影响

为探索不同浓度内生真菌GG22诱导子与地黄毛状根共培养不同时间后,对毛状根的生长及次生代谢产物合成的影响,本试验通过制备地黄内生真菌GG22诱导子溶液,加入已培养23 d的毛状根液体培养基中,使含诱导子的多糖浓度分别为0(对照)、10、30、50和100 mg·L^(-1),共培养0、3、5、8、11 d后,分别测定地黄毛状根的鲜重、干重、总环烯醚萜苷及毛蕊花糖苷的含量。结果表明,加入诱导子溶液的试验组毛状根的鲜重、干重、总环烯醚萜苷及毛蕊花糖苷的含量比对照组高。且通过变异系数权重法分析综合得分,得出最适宜诱导条件为诱导子浓度50 mg·L^(-1),共培养11 d。由此推测地黄内生真菌GG22诱导子在一定诱导浓度和培养天数下能够促进地黄毛状根的生长,并提高其次生代谢产物的含量。本试验结果为进一步研究地黄内生真菌GG22诱导子促进地黄次生代谢产物积累的分子机制提供了基础。

美洲商陆PaENO基因克隆及其表达分析

烯醇化酶(enolase,ENO)作为糖酵解途径的一个酶,还能够参与植物生长发育以及应对非生物胁迫。该研究以镉超富集植物———美洲商陆(Phytolacca americana L.)为材料,根据美洲商陆转录组数据,设计特异性引物,从叶片中克隆PaENO基因,并进行序列分析、原核表达与纯化、表达模式分析以及抗镉实验,为深入研究PaENO蛋白的酶活性质以及PaENO基因在美洲商陆应对镉胁迫过程的功能机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得PaENO基因(GenBank登录号为JN656932.1),该基因开放阅读框为1335 bp,编码444个氨基酸。(2)多序列比对分析显示,PaENO蛋白与冰叶日中花的ENO蛋白序列一致性最高,为93.47%;系统进化分析表明,PaENO与冰叶日中花、甜菜、菠菜的亲缘关系较近,处于同一进化分支。(3)RT-PCR结果显示,PaENO基因在美洲商陆叶中表达量最高为根的2.5倍,茎中表达量最低,仅为根的1/5;Cd胁迫后PaENO基因表达水平显著升高,并于2 h时PaENO基因表达量迅速升高至Cd胁迫前(0 h时)的9.54倍,Cd胁迫12 h、24 h时降低到0 h时的3.12倍和2.89倍,说明PaENO基因参与了美洲商陆应对Cd胁迫的响应。(4)通过成功构建原核表达载体pET28a-PaENO并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,在50 kD左右出现目的条带,然后用超声破碎大肠杆菌细胞,离心后分别取上清和沉淀,SDS-PAGE检测发现,PaENO在上清和沉淀中都有表达,而且在上清中的表达量较高;使用Ni亲和层析试剂盒纯化PaENO蛋白,获得了纯化的PaENO蛋白;镉抗性实验结果初步证实,表达PaENO蛋白能够显著提高大肠杆菌对镉的抗性。研究认为,PaENO蛋白可能以转录因子(PaMBP-1)的形式在美洲商陆应对镉胁迫过程中发挥调控作用。

夏枯草DXR基因的克隆和表达分析

目的:克隆夏枯草1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因并分析该基因的表达特性。方法:采用逆转录PCR技术克隆夏枯草DXR基因全长,并对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR法分析PvDXR在不同组织及不同外源性物质诱导下的表达特性。结果:PvDXR基因编码全长为1422 bp,编码473个氨基酸组成的蛋白质序列,理论分子量为51351.49 D,为不稳定蛋白并具疏水性,含有2个跨膜螺旋区。PvDXR基因在叶中表达最高,茎中次之,果穗中表达量最少。7种外源性物质处理24 h后该基因在果穗中的表达量均有所降低,且ETH、GA3及CaCl2处理后基因的表达量降低最多。结论:获得PvDXR基因的全长cDNA,并揭示了其在不同组织及外源性物质诱导下的表达差异,为后续研究PvDXR基因在夏枯草三萜类成分合成途径中的功能奠定基础。

夏枯草转录组SSR位点信息分析

目的:分析夏枯草转录组中简单重复序列(SSR)信息,为开发夏枯草新的分子标记奠定基础。方法:使用Micro SAtelite(MISA)软件对转录组序列进行SSR位点搜索并利用Primer3软件设计引物。结果:发现4248条Unigenes序列中含有5450个SSR位点,发生频率为27.50%,平均每5933 bp含1个SSR位点;二核苷酸、三核苷酸和单核苷酸重复是其优势重复类型,分别占总SSR数量的44.59%、28.44%、24.75%;在夏枯草转录组中共发现160种重复基元,其中以AG/CT比例最高,约25%,其次是A/T,约占24.26%;夏枯草转录组SSR以5~11次重复为主,其中75.97%的基序长度集中在12~20 bp;共得到4228对SSR位点特异性引物。结论:夏枯草转录组SSR位点出现频率高、重复类型丰富、密度大、多态性较高,通过对夏枯草转录组资源SSR信息的研究,为进一步开发夏枯草SSR分子标记奠定了基础。

响应内生菌侵染的两个地黄茉莉酸合成关键基因的克隆与表达分析

丙二烯氧化物合酶(allene oxide synthase,AOS)、12-氧代植二烯酸还原酶(12-oxophytodienoate reduc⁃tase,OPR)基因是植物中茉莉酸合成关键基因。从地黄与内生真菌GG22互作转录组中筛选响应内生菌侵染的AOS和OPR基因序列,设计特异引物,克隆RgAOS和RgOPR基因的完整开放阅读框,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术分析RgAOS和RgOPR基因在不同组织及内生真菌GG22侵染前后的表达模式。RgAOS基因开放阅读框为1626 bp,编码541个氨基酸,分子量为60.20 kD。RgOPR基因的开放阅读框为1197 bp,编码398个氨基酸,分子量为44.07 kD。QPCR分析发现,RgAOS在根中表达量最高,花中最少,RgOPR在花和叶中的表达量较高。内生真菌GG22能诱导地黄中RgAOS和RgOPR基因的表达。该研究成功从地黄中克隆了RgAOS和RgOPR基因,为进一步研究地黄中茉莉酸类物质的生物活性及探索内生真菌对地黄次生代谢产物调节的分子机制奠定了基础。

红花SPL基因家族全基因组鉴定及表达分析

SPL基因家族是植物特有的转录因子,广泛参与调控植物生长发育,包括花和果实的发育、胁迫响应和次生代谢物的合成等。为探究红花SPL基因家族的进化和功能,本研究基于红花基因组数据库筛选得到21个SPL基因,利用生物信息学方法对其进行分析。结果表明,红花SPL基因家族鉴定得到的21个成员聚类为6个亚家族,同一个亚家族成员具有相似的基因结构和基序,大多数CtSPL蛋白具有1个完整保守的SBP结构域;CtSPL基因启动子区域存在光反应元件,激素应答元件、胁迫响应元件以及和植物生长发育有关的调控元件;miRNA靶位点预测表明有15个CtSPL基因受miR156家族的调控;表达模式分析表明,CtSPL基因呈现组织特异性表达。经茉莉酸甲酯(MeJA)和表油菜素内酯(EBR)处理后,多数CtSPL基因表达量发生变化,推测这些基因参与了红花不同激素的响应。

土壤含水量对地黄产量及质量的影响

目的:评价土壤含水量对地黄产量及质量的影响。方法:在地黄生长期的不同阶段调整土壤的含水量,收获后测定不同含水量土壤所产地黄药材的产量、浸出物和梓醇、毛蕊花糖苷及多糖的含量,使用灰色模式识别法对实验数据进行分析。结果:土壤含水量影响为中水分(M2)>高水分(M3)>低水分(M1)>空白(M4)。结论:地黄栽培过程中,土壤含水量在苗期应保持在40%-50%,块根形成期和块根膨大期应为50%-60%,收获期应为20%-30%,合理调节土壤含水量能够显著提高地黄的产量及质量。