人干扰素α1b喷雾剂抑菌剂筛选及抑菌效力研究

目的:探索人干扰素α1b喷雾剂制剂处方中抑菌剂及其最低有效抑菌浓度,确定抑菌剂的合理添加剂量。方法:应用生物学活性检测方法进行人干扰素α1b喷雾剂制剂处方中抑菌剂的筛选,确定抑菌剂,然后按照2020年版《中华人民共和国药典》通则1121抑菌效力检查法测定抑菌效力确定抑菌剂的最低有效抑菌浓度。以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉为试验菌株,进行菌落计数方法适用性试验。设计抑菌剂剂量筛选试验,对不同浓度的抑菌剂分别对4种试验菌的抑菌效果进行考察,筛选出抑菌剂的合理添加量。结果:筛选出人干扰素α1b喷雾剂制剂处方中的抑菌剂为苯扎溴铵;苯扎溴铵浓度为0.05~0.1 mg·mL^(-1)时对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的抑菌效力均符合A级。结论:确定了人干扰素α1b喷雾剂制剂处方中抑菌剂苯扎溴铵的最低有效抑菌浓度为0.05 mg·mL^(-1)。

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂制剂和沉淀中相关蛋白化学修饰类型的鉴定

目的 鉴定重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptor antagonist,rhIL-1Ra)制剂和室温加速获得的制剂沉淀中相关蛋白的化学修饰类型。方法 利用反相高效液相色谱(reverse phase-high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)对rhIL-1Ra制剂和室温加速获得的制剂沉淀进行相关蛋白检测,并按面积归一化法确定相关蛋白的百分比;再用液质联用质谱法对rhIL-1Ra制剂和室温加速获得的制剂沉淀进行相关蛋白的鉴定。结果 RP-HPLC结果显示,rhIL-1Ra制剂中有6个相关蛋白色谱峰,所占百分比依次为0.414%、0.870%、0.871%、0.304%、0.104%、1.182%,rhIL-1Ra室温加速获得的沉淀中有5个相关蛋白色谱峰,所占百分比依次为0.350%、3.603%、1.118%、0.629%、0.866%。液质联用结果显示,rhIL-1Ra制剂6个相关蛋白色谱峰化学修饰类型分别为甲硫氨酸氧化、天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化、甲硫氨酸氧化、甲硫氨酸氧化、天冬氨酸脱水环化、天冬氨酸脱水环化;rhIL-1Ra室温加速获得的沉淀中5个相关蛋白色谱峰化学修饰类型分别为甲硫氨酸氧化、天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化、以甲硫氨酸氧化为主、以天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化为主、以天冬氨酸脱水环化为主。结论 rhIL-1Ra制剂和室温加速获得的制剂沉淀的相关蛋白修饰类型相同,主要存在3种:甲硫氨酸氧化修饰、天冬氨酸脱水环化、天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化,本研究为提高rhIL-1Ra制剂的质量提供了参考。

报告基因法检测人生长激素生物学活性

目的建立报告基因法(reporter gene assay,RGA)检测人生长激素(human growth hormone,hGH)的生物学活性,并对方法进行验证。方法通过hGH能与HEK293/GH-Luc细胞膜上的hGH受体(hGH receptor,hGHR)结合激活荧光素酶(luciferase,Luc)的表达评价hGH的生物学活性。建立的方法检测条件为:样品起始浓度1μg/mL;细胞接种量为(2.45~2.66)×10^(4)个/孔;样品3倍系列稀释,共8个稀释度;孵育时间为18~24 h。通过测定Luc强度,并经四-参数拟合与国家标准品进行比较计算样品的相对生物学活性。对建立的方法进行专属性、重复性、中间精密度、相对准确度、线性范围、耐用性验证。结果产品中辅料成分及培养基中血清成分不会对活性检测结果产生影响;1批样品重复检测6次相对效价的几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)为6.794%,远低于20%;2名实验员不同时间对不同批次样品检测的相对效价GCV均低于20%;不同浓度供试品相对效价测定值的相对偏差均在±12%范围内,线性回归方程的斜率为0.982,线性范围为0.6~1.6μg/mL,决定系数(R^(2))为0.997;3批原液及1批成品在不同细胞代次、细胞密度及加样位置的条件下,相对效价测定值的GCV分别为4.758%、4.430%、7.294%和2.771%,均小于20%。结论建立的RGA法专属性、重复性、中间精密度、相对准确度、线性范围和耐用性良好,均符合应用要求,有望替代传统体内生物学活性检测方法,用于hGH的活性评价及质量控制。

人生长激素Fc融合蛋白电荷异质性全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析方法的建立及验证

目的建立全柱成像毛细管等电聚焦电泳(image capillary isoelectric focusing,iCIEF)方法分析重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)Fc融合蛋白(Fc-rhGH)的电荷异质性,并对方法进行验证。方法通过对目标蛋白浓度、助溶剂(尿素)浓度、聚焦时间的优化建立Fc-rhGH的iCIEF分析方法。采用该方法与传统平板等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)同时分析目标蛋白,并比较分析结果;对建立的方法进行特异性、准确性、精密性、定量限(limit of quantitation,LOQ)、耐用性验证。结果优化后的方法为采用8 mol/L尿素、0.35%甲基纤维素(methyl cellulose,MC)、4%两性电解质、0.5%等电点标记物混合溶液为样品缓冲液,聚焦条件为:1500 V 1 min,3000 V 5.5 min。IEF不适用于分析Fc-rhGH原液的电荷异质性。采用优化的iCIEF进行分析,目标蛋白能明显区别于非相关蛋白,且空白试剂基线平稳;准确性验证回收率在90%~110%之间,线性范围为0.25~0.75 mg/mL(目标上样量的50%~150%);重复性验证中各异构体pI的RSD均小于0.3%,峰面积百分比RSD均小于5%;定量限为0.04 mg/mL;方法的样品保存时间耐用性、两性电解质pharmalyte 3-10耐用性和MC耐用性良好。采用该方法分析Fc-rhGH理化对照品的电荷异质性,可有效分离对照品的8个电荷异质体,pI范围在5.9~6.4。结论建立的iCIEF法具有良好的特异性、准确性、精密性、耐用性,比传统平板IEF更适合高效分析Fc-rhGH的电荷异质性,对Fc-rhGH及其他Fc融合蛋白的质量控制具有重要意义。

CHO细胞表达重组人生长激素-Fc融合蛋白糖基化类型的优化

目的优化CHO细胞表达重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白,以获得更优的糖基化比例及更低含量的高甘露糖。方法在7 L生物反应器中培养表达rhGH-Fc的CHO细胞,通过改善补料培养基成分(使用3种商业化培养基:Gly-1:EX-CELL Glycosylation Adjust、Gly-2:SHEFF-CHO PLUS PG ACF、Gly-3:EfficientFeed C+AGT Supplement&GlycanTune C+Total Feed),对rhGH-Fc糖基化修饰进行调整,并通过质谱分析目的蛋白的糖基化类型及比例。结果Gly-1、Gly-2、Gly-3的G0F(主要糖型一般为G0、G1和G2,F为岩藻糖)分别为32.89%、58.66%、33.28%,G1F分别为31.39%、18.03%、34.90%,G2F分别为31.39%、18.03%、34.90%,Gly-1与Gly-3使目的蛋白含有更少的G0F及更多的G2F;Gly-3补料方案在高甘露糖修饰方面较其他两种方案更少。结论Gly-1培养基使糖基化修饰从G0F向G1F、G2F转变,Gly-2培养基使糖基化修饰从G2F、G1F向G0F转变,Gly-3培养基使糖基化修饰从G0F向G1F、G2F转变,且高甘露糖含量在5%以下。Gly-3培养基可能具有更好的修改目的蛋白糖基化类型及比例的效果。

基于2020年版《中华人民共和国药典》相关蛋白检测方法并联合质谱分析人干扰素α2b相关蛋白的一级结构

目的:用人干扰素α2b相关蛋白检测方法联合质谱对人干扰素α2b相关蛋白进行一级结构分析,确认不同保留时间的相关蛋白。方法:液相色谱条件为Agilent ZORBAX C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,300?,5μm);流动相A为30%乙腈水溶液(含0.2%三氟乙酸),流动相B为80%乙腈水溶液(含0.2%三氟乙酸),流速为0.5 mL·min^(-1),柱温为室温。质谱条件为电喷雾正离子模式,采用MS模式进行扫描,毛细管电压为2500 V,Cone电压为40 V,去溶剂气体温度为350℃,源温为120℃,去溶剂气体流速为800 L·h^(-1),扫描范围为m/z 400~4000,碰撞电压为40 V,MS采集时间为20~60 min。结果:相关蛋白的相对分子质量均与理论相对分子质量一致,3号峰为主峰,相对分子质量为19264.81和19395.93,为人干扰素α2b和N-末端甲硫氨酸化人干扰素α2b;1号峰相对分子质量为19280.72,为氧化人干扰素α2b,2号峰相对分子质量为19412.25,为(氧化+N-末端甲硫氨酸化)人干扰素α2b;4号峰相对分子质量为19265.13,为人干扰素α2b;5号峰相对分子质量为19322.81,为(氧化+N-末端乙酰化)人干扰素α2b;6号峰相对分子质量为19306.79,为N-末端乙酰化人干扰素α2b。结论:确认主峰为人干扰素α2b和N-末端甲硫氨酸化的人干扰素α2b,确认保留时间在主峰前面的相关蛋白分别为氧化和(氧化+N-末端甲硫氨酸化)修饰的人干扰素α2b,保留时间在主峰后面的相关蛋白分别为(氧化+N-末端乙酰化)和N-末端乙酰化修饰的人干扰素α2b。

液相色谱质谱对重组人生长激素-Fc(CHO细胞)二硫键连接的确认

目的利用液相色谱质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)对重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc二硫键连接进行确认。方法液相色谱条件为色谱柱:CSHC18(2.1 mm×100 mm,130Å,1.7μm);流动相A:100%水(含0.1%甲酸);流动相B:100%乙腈(含0.1%甲酸);流速:0.3 mL/min;柱温:65℃;上样量:5μL,梯度洗脱。质谱条件:MS^(E)采集模式;毛细管电压:2 500 V;Cone电压:40 V;去溶剂气体温度:350℃;源温:120℃;去溶剂气体流速:600 L/h;一级质谱扫描范围:100-2 000 m/z。样品用8 mol/L盐酸胍于50℃变性30 min、1 mol/L碘乙酰胺室温烷基化0.5 h,离心置换成50 mmol/L NH_(4)CO_(3)(pH 8.0)缓冲液后,用胰酶(w/w,1∶15)37℃酶解4 h,利用LC-MS对酶解的肽段进行采集和分析。结果确认rhGH-Fc二硫键连接为Cys53-Cys165,Cys182-Cys189,1∶Cys210-2∶Cys210,1∶Cys213-2∶Cys213,Cys245-Cys305,Cys351-Cys409,与理论连接一致。结论建立了稳定的LC-MS方法分析rhGH-Fc的二硫键连接,可用于rhGH-Fc的常规分析。

卡式瓶多剂量重组人干扰素α2b注射液与冻干制剂的比对研究及优势分析

目的通过剂型比对探讨卡式瓶多剂量重组人干扰素α2b注射液的剂型优势。方法将长春生物制品研究所有限责任公司在研卡式瓶多剂量重组人干扰素α2b注射液与同公司市售注射用重组人干扰素α2b各3批,同时置(25±2)℃避光条件下储存,0、1、2、3和6个月取样,亲和层析前处理浓缩后样品,分别进行非还原型SDSPAGE、SEC-HPLC、质谱肽图、质谱二硫键分析,比对两种剂型中蛋白聚合、降解、修饰产物种类及变化趋势;未经处理样品直接进行生物学活性检测,比对两种剂型有效性指标的变化趋势。结果SDS-PAGE和SEC-HPLC分析结果相符,两种剂型在加速比对研究周期内均可见蛋白二聚体产生,冻干制剂可见多种蛋白多聚体产生,液体制剂仅见单一种类的蛋白多聚体产生,冻干制剂的电泳纯度和色谱纯度下降趋势较液体制剂明显;质谱分析结果显示,两种剂型均产生了乙酰化修饰产物、氧化修饰产物和二硫键错配产物,两种剂型内各种修饰产物的变化趋势趋于一致;两种剂型生物学活性无明显下降趋势,稳定程度相似。结论长春生物制品研究所有限责任公司卡式瓶多剂量重组人干扰素α2b注射液(25±2)℃存放6个月内聚合产物少,蛋白纯度下降速度慢,生物学活性稳定无降低趋势,极具剂型优势。

重组人生长激素的原核分泌表达及其活性分析

目的构建重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)分泌表达质粒,进行原核表达,并分析其活性。方法人工合成包含phoA启动子、STⅡ信号肽序列及hGH基因优化序列的目的基因,与pBR322载体连接,构建重组克隆质粒pBR322-hGH;再将目的基因亚克隆至pACYC184载体,构建重组表达质粒pAC-hGH,进行酶切鉴定及测序分析。将鉴定正确的重组表达质粒pAC-hGH转化至感受态大肠埃希菌W3110中,构建重组工程菌,经诱导表达后进行DEAE-Sepharose FF纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻色谱、N-末端氨基酸序列及活性分析。结果重组表达质粒经酶切及测序鉴定,构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析可见相对分子质量约22 000的目的条带,菌体相对表达量达30%以上;纯化产物电泳纯度达95%以上,分子排阻色谱保留时间及N-末端15个氨基酸均与国家标准品一致,比活性大于3.0 IU/mg。结论成功构建了分泌表达rhGH的重组质粒,且获得了纯度及活性均较高的rhGH,为其产品的开发奠定了基础。

高效液相色谱法检测重组人干扰素α2b注射液中间甲酚含量

目的建立重组人干扰素α2b(recombinant human interferon α2b,rhIFNα2b)注射液中间甲酚含量高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法,并对方法进行验证。方法采用RP-HPLC法,选用ZORBAX 300SB-C18(4. 6 mm×250 mm 5-Micron)色谱柱,流动相为水∶甲醇(50∶50),柱温45℃,上样量20μL,流速0. 5 mL/min,检测波长270 nm。对方法进行线性、专属性、准确性、精密性、定量限及耐用性验证。分别采用建立的方法及《中国药典》四部(2015版)4-氨基安替比林分光光度法测定3批rhIFNα2b注射液中的间甲酚含量,比较两种方法的测定结果。结果该方法在间甲酚含量为1 000～0. 1μg/mL范围内线性良好,R^2为0. 999 3;药用辅料与IFN蛋白对间甲酚含量检测无干扰;该方法检测高、中、低3种浓度样品的平均回收率分别为97. 10%、99. 00%和103. 94%,总的平均回收率为100. 01%;重复性验证中RSD为0. 105%,中间精密性验证中RSD为0. 26%;该方法的定量限为0. 1μg/mL;同一色谱柱条件下,不同设备与不同时间配制的流动相对检测结果无明显影响;而使用不同程度色谱柱理论塔板数有明显差异。结论建立的HPLC检测方法专属性、精密性、耐用性良好,准确性高,可用于检测rhIFNα2b注射液中的间甲酚含量。

长效生长激素相关蛋白含量检测反相高效液相色谱法的建立及验证

目的建立长效生长激素(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)相关蛋白含量检测的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,并进行验证。方法通过质谱肽图法进行rhGH-Fc相关蛋白结构解析后建立相关蛋白含量检测的方法,优化梯度洗脱方法和流动相方案,并对该方法进行重复性、专属性、耐用性验证,确定检测限和定量限。用建立的方法检测rhGH-Fc氧化加速试验样品、脱酰胺加速试验样品及不同批次纯化液样品。结果建立的RP-HPLC法色谱柱为ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm,5-Micron),柱温45℃,上样量40μg,流速0.7 mL/min,检测波长280 nm;流动相A为30%乙腈+0.1%三氟乙酸,流动相B为80%乙腈+0.1%三氟乙酸;梯度洗脱方法为0~10 min,10%B→50%B;10~50 min,50%B→90%B。rhGH-Fc的相关蛋白主要产生在4个氧化位点和2个脱酰胺位点处。建立的RP-HPLC检测方法重复性验证RSD为1.8%;蛋白缓冲液对检测结果无干扰;耐用性验证RSD为0.05%;在相同色谱柱条件下,不同设备、不同时间配制的流动相、不同柱温对检测结果无明显影响;方法检测限为0.01 mg/mL,定量限为0.025 mg/m L。结论成功建立了rhGH-Fc相关蛋白含量的RP-HPLC检测方法,该方法重复性、专属性、耐用性良好,可用于rhGH-Fc相关蛋白含量的检测。

鳉鱼肠激酶在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及活性鉴定

目的利用大肠埃希菌表达系统实现鳉鱼肠激酶(enterokinase,EK)的可溶性表达,经纯化后获得具有酶切活性的重组鳉鱼EK。方法通过基因工程技术,构建pGEX-EK重组质粒,转化至TransB(DE3)化学感受态细胞,IPTG诱导表达获得可溶的GST-EK融合蛋白,经谷胱甘肽(glutathione,GSH)亲和层析、离子交换层析,获得EK,并进行活性分析及酶切特异性试验。结果pGEX-EK重组质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,经可溶性标签实现了具有生物活性的鳉鱼EK的可溶性表达,酶比活性为46 IU/mg,且具有较高的酶切特异性。结论通过使用GST融合标签成功实现了鳉鱼EK在大肠埃希菌中的可溶性表达,为实现EK的可溶性表达提供了新思路。