Paxlovid对肺移植患者他克莫司血药浓度影响的研究

目的探索奈玛特韦片/利托那韦片组合包装(Paxlovid)对肺移植患者他克莫司(Tacrolimus,TAC)血药浓度的影响,为肺移植术后的新型冠状病毒感染患者服用Paxlovid与TAC时的用药安全提供合理参考。方法回顾性分析2022年11月1日至2023年1月31日中日友好医院收治的5例肺移植术后服用Paxlovid的患者(服用Paxlovid之前,5例患者的TAC血药浓度均已达稳态),测定服用Paxlovid期间及之后的TAC谷浓度,记录Paxlovid停药后重新启用TAC的时间和剂量,同时收集用药期间患者的肝肾功能指标数据。结果在Paxlovid使用期间,3例患者的TAC血药浓度分别下降19.4%、8.4%、14.7%,另外2例分别升高了21.6%、80.6%。重新启用TAC之后,3例患者TAC谷浓度出现了先上升(平均上升59.5%)后下降(平均下降33.3%)的趋势,而另外2例患者TAC谷浓度则一直持续下降。4例患者分别是在TAC血药浓度为基线水平的47.2%、72.6%、83.8%、60.3%时开始恢复使用TAC,1例则是在基线水平的171.2%开始启用TAC。2例患者以基线剂量开始启用TAC,另外3例患者分别以85.7%、44.4%、90.9%的基线剂量开始重新使用。结论Paxlovid会对TAC血药浓度产生影响,不仅是在Paxlovid治疗期间,甚至持续至停药后第6天,存在显著的个体差异,建议在患者治疗期间严密监测TAC血药浓度,根据血药浓度实行个体化TAC给药方案。

糖络宁含药血清对高糖环境下RSC96细胞Keap1/Nrf2/Bcl-2途径的作用机制研究

目的针对糖尿病周围神经病变氧化应激的核心发病机制,以Keap1/Nrf2/Bcl-2途径为切入点,观察糖络宁对高糖环境下雪旺细胞的氧化应激和细胞凋亡的影响,探讨糖络宁防治DPN的可能作用机制。方法采用150 mmol/L葡萄糖培养雪旺细胞,随机分为空白对照组(Control)、高糖组(High Glucose)、α-硫辛酸含药血清组(ALA)、糖络宁含药血清组(TLN)。干预36 h后,应用流式细胞仪检测高糖环境下雪旺细胞超氧自由基和细胞凋亡,应用JC-1探针观察高糖环境下雪旺细胞线粒体膜电势(MMP),应用高内涵分析(HCA)法和Western Blot分析高糖环境下雪旺细胞Keap1/Nrf2通路中Keap1、Nrf2、HO-1和γGCS蛋白表达的变化及细胞凋亡调节蛋白Bcl-2、Bax、Cyto C和Caspase-3的蛋白表达的变化。结果高糖干预36 h后,与空白对照组比较,高糖组细胞凋亡、ROS含量增加,MMP降低(P<0.01);与高糖组比较,糖络宁组能够降低细胞凋亡和ROS含量,增加MMP(P<0.05或P<0.01)。HCA和Western Blot分析结果显示,与空白对照组比较,高糖组Keap1、Nrf2、HO-1和γGCS增加(P<0.01或P<0.05);与高糖组比较,糖络宁组能进一步增加Keap1、Nrf2、HO-1和γGCS蛋白表达(P<0.01或P<0.05)。与空白组比较,高糖组Bcl-2、Bax、Cyto C和Caspase-3蛋白表达增加(P<0.01或P<0.05);与高糖组比较,糖络宁组能够增加Bcl-2蛋白表达,降低Bax、Cyto C和Caspase-3蛋白表达(P<0.01或P<0.05)。结论糖络宁能够抑制高糖环境下雪旺细胞的氧化应激和细胞凋亡,与上调Keap1/Nrf2通路的蛋白表达对抗氧化应激,调控Bcl-2相关细胞凋亡通路的蛋白表达从而抑制细胞凋亡有关。

糖络宁对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经功能及内质网应激IRE1α-XBP-1-CHOP通路的影响

目的探讨糖络宁对糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)大鼠内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)IRE1α-XBP-1-CHOP通路的影响。方法建立DPN大鼠模型,设置空白对照组(Control)、模型对照组(Model)、氧化三甲胺组(TMAO)、糖络宁低剂量组(LTLN)和糖络宁高剂量组(HTLN),分别灌胃给药12周。采用放射免疫试剂盒测定稳态胰岛素抵抗指数;采用透射电镜和劳克坚劳蓝染色观察坐骨神经结构;测定鼠尾热痛阈值、神经传导速度和蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5, PGP 9.5)蛋白的表达并检测周围神经功能;采用Western blot法检测葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP 78)、X盒结合蛋白1(X-box binding protein1, XBP-1)、凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein Homologous protein, CHOP)、B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)和磷酸化真核翻译起始因子2α(phospho-ukaryotic translation initiation factor 2α, P-eIF 2α)的蛋白表达;通过免疫荧光组织化学法检测肌醇激酶1 (inositol requiring enzyme1α, IRE 1α)、生长停滞及 DNA损伤基因34 (growth-arrest and DNA damage-inducible gene 34, GADD 34)和内质网氧化蛋白(endoplasmic oxidoreductin-1-like, Ero1α)指标。结果与模型组比,糖络宁高、低剂量组能够有效改善坐骨神经的结构和功能,并能够影响内质网应激IRE1α-XBP-1-CHOP凋亡通路提高GRP 78、Bcl-2和P-eIF 2α的表达(P<0.05),降低P-IRE1α、XBP-1、CHOPGADD 34、Bax和Ero1α的表达(P<0.05)。结论糖络宁能够通过抑制ER stress中IRE1α-XBP-1-CHOP凋亡途径相关蛋白的表达,从而减轻ER stress诱导的细胞凋亡,改善坐骨神经的结构和功能从而防治DPN。

糖络宁对DPN中IRE1-TRAF2-XBP-1途径的影响

目的探讨糖络宁对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠内质网应激IRE1-TRAF2-XBP-1途径的影响。方法以高脂饲料联合链脲佐菌素诱导SD大鼠致DPN模型,经糖络宁干预12周后,采用苏木精-伊红(HE)染色法观察大鼠坐骨神经形态的变化,采用免疫荧光法检测DPN大鼠坐骨神经EDEM、PDI和TRAF2蛋白表达,采用Western blot法检测DPN大鼠坐骨神经细胞凋亡途径P-JNK和caspase-3的蛋白表达。选用RSC96细胞株,采用高糖环境培养的施万细胞模型,用糖络宁含药血清分别干预24h和48h,采用高内涵分析方法分别测定糖络宁含药血清对施万细胞中EDEM、PDI、TRAF2和P-JNK蛋白表达的影响。结果 HE染色结果显示,模型组大鼠坐骨神经髓神经脱髓鞘严重;糖络宁低、高剂量组坐骨神经脱髓鞘现象得到改善,坐骨神经髓鞘积分吸光度显示,模型组比空白组明显降低(P <0. 05),糖络宁高剂量组得到明显改善(P <0. 05);免疫荧光结果显示,糖络宁高低剂量组能使EDEM和PDI表达增加(P <0. 01,P <0. 05),TRAF2表达降低(P <0. 01,P <0. 05); Western blot法检测结果显示,糖络宁高低剂量均显示P-JNK和caspase-3的表达降低。细胞实验中,24h和48h干预后的150mmol/L葡萄糖组EDEM与PDI显著性降低(P <0. 01),TRAF2与P-JNK显著性升高(P <0. 01);高糖高剂量组的EDEM在24h干预后的表达显著升高(P <0. 01),而P-JNK表达显著降低(P <0. 05); PDI在48h干预后的表达显著升高(P <0. 01);高糖高、低剂量组的TRAF2在24h和48h干预后均显著降低(P <0. 01)。结论糖络宁能够改善受损的坐骨神经结构,与糖络宁影响内质网应激相关IRE1-TRAF2-JNK途径相关,通过促进EDEM和PDI的表达,抑制TRAF2、P-JNK和caspase-3的表达,从而抑制神经细胞凋亡,改善DPN。

糖尿病周围神经病变中内质网应激诱导的细胞凋亡机制研究进展

糖尿病周围神经病变(DPN)的发病机制复杂,不可缓解的内质网应激反应(ERS)可诱导细胞凋亡,损伤神经细胞结构和功能,从而导致DPN。当未折叠的或折叠错误的蛋白在内质网上过度积累时,会触发内质网产生一系列应激反应以保护细胞,即未折叠蛋白反应(UPR),一般用UPR来提示ERS的发生。UPR主要包括3个信号通路:蛋白激酶R样内质网激酶通路、激活转录因子6通路和肌醇需求酶1通路。分析DPN中ERS诱导的细胞凋亡机制,可为预防和治疗DPN提供参考及新思路。

芍药苷调节高糖环境下线粒体相关内质网膜对雪旺细胞凋亡的影响

目的探讨芍药苷(paeoniflorin,PF)调节高糖环境下线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)干预雪旺细胞(schwann Cell,SCs)凋亡的机制。方法采用高糖环境下的SCs模型,观察PF对高糖环境下24和48小时RSC96细胞的影响;设立空白对照组,模型对照组,PF低、中、高剂量组;采用激光共聚焦法观察MAMs的形态并检测其含量;采用流式细胞术检测细胞内的钙离子浓度(Ca 2+);采用Western blot法定量检测MAMs中线粒体融合蛋白2(Mitofusin2,Mfn2)的表达;采用Elisa法检测MAMs中蛋白激酶R样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)的表达。结果干预24和48小时后,(1)模型对照组SCs形态由棱形变为不规则圆形,其MAMs的含量和质量均比空白对照组下降(P<0.01),不同浓度的PF组SCs形态有所改善,MAMs的含量与质量均比模型对照组有明显提升(P<0.01);(2)模型对照组Mfn2表达比空白对照组明显下降(P<0.01),PF低、中、高剂量组Mfn2表达均比模型对照组明显提升(P<0.01);(3)模型对照组PERK表达比空白对照组明显升高(P<0.01),PF低、中、高剂量组PERK表达比模型对照组显著下降(P<0.05或P<0.01);(4)模型对照组细胞内Ca 2+比空白对照组明显提高(P<0.01),PF低、中、高剂量组比模型对照组均显著降低(P<0.01)。结论PF能够通过上调Mfn2的表达并抑制PERK表达,增加SCs内MAMs数量,改善SCs形态,降低细胞内Ca 2+,减轻钙超载,从而减少SCs凋亡,有利于改善糖尿病周围神经病变。

芍药苷干预施万细胞外泌体对背根神经元细胞凋亡的作用

目的探讨芍药苷(paeoniflorin,PF)干预高糖环境施万细胞(Schwann cell,SCs)外泌体(exosomes,EXOs)对背根神经节神经元(dorsal root ganglion neurons,DRGn)细胞凋亡的影响。方法取高糖环境SCs,培养24h,透射电镜观察EXOs的形态,蛋白印迹法(Western blot)鉴定EXOs特异性标志蛋白和氧化应激的蛋白表达;将SCs来源的EXOs与DRGn共培养24h,激光共聚焦显微镜观察DRGn摄取SCs来源EXOs的情况,Western blot法检测DRGn中影响细胞凋亡蛋白的表达水平。结果EXOs形态为双层膜囊泡结构,直径在40~100nm;EXOs中标记蛋白CD63表达证实了EXOs特异性;EXOs中氧化应激蛋白表达升高,尤其是PF干预SCs来源EXOs中Nrf2、HO-1的表达升高更明显;SCs来源EXOs被DRGn摄取,分布于DRGn细胞核周围;经PF干预SCs来源EXOs影响DRGn促凋亡蛋白GADD153和Bax表达显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显增加。结论PF通过SCs EXOs携带氧化应激信息,影响DRGn中促凋亡蛋白表达减少,抗凋亡蛋白表达增加,从而减轻DRGn细胞凋亡,有利于改善糖尿病周围神经病变。

硫辛酸注射液致过敏性休克1例

报道1例硫辛酸注射液致过敏性休克的病例。患者,男性,79岁,以“双下肢麻木感14年,肢体活动不利加重1年”为主诉入院,予硫辛酸注射液600 mg避光静脉滴注及其他药物对症治疗。在硫辛酸注射液静脉滴注过程中患者出现呕吐、喘憋伴咳嗽,呕吐物为胃内容物,双腕桡侧出现红色片状斑,双手皮肤绯红并逐渐加重,测血压180/75 mmHg,心率120次·min^(-1),考虑药物过敏可能性大,停用硫辛酸注射液。经治疗,患者症状消退,生命体征好转。

C/EBP同源蛋白siRNA对糖尿病周围神经病变大鼠脊髓PERK-ATF4-CHOP通路mRNA的影响

目的观察C/EBP同源蛋白(CHOP)siRNA对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠脊髓RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)-转录活化因子4(ATF4)-CHOP通路相关因子mRNA表达的影响。方法采用高脂饲料喂养联合腹腔注射STZ复制DPN大鼠模型,分为空白对照组(Con)、模型对照组(Mod)、Con+CHOP siRNA组和Mod+CHOP siRNA组,分别鞘内注射转染试剂或CHOP siRNA,取L4～5下脊髓,检测PERK、真核翻译起始因子2a(eIF2a)、ATF4、CHOP、Bcl-2和Bax mRNA表达水平。结果与Con组比较,Mod组PERK[(1. 04±0. 03)vs(1. 40±0. 10)]、eIF2a[(1. 01±0. 14)vs(1. 64±0. 13)]、ATF4[(1. 02±0. 07)vs(1. 13±0. 07)]、CHOP[(1. 06±0. 05)vs(1. 25±0. 07)]和Bax[(1. 01±0. 04)vs(1. 75±0. 09)]mRNA表达均升高(P<0. 05或P<0. 01),而Bcl-2[(1. 00±0. 16)vs(0. 55±0. 06)]表达降低(P<0. 01);与Mod组比较,Mod+CHOP siRNA组PERK、eIF2a、ATF4、CHOP和Bax的mRNA表达降低(P<0. 01),Bcl-2表达升高(P<0. 01)。结论 CHOP siRNA干预能抑制DPN大鼠脊髓中PERK-CHOP凋亡通路,从而减轻脊髓脱髓鞘,缓解神经病变。

糖络宁对DPN大鼠和雪旺细胞内质网应激PERK通路的影响

目的：观察糖络宁对糖尿病周围神经病变（DPN）大鼠和雪旺细胞内质网应激RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PERK）通路相关蛋白和mRNA表达的影响。方法：60只SD雄性大鼠,除空白组外,其余各组大鼠采用高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素（STZ,35 mg·kg^-1）复制DPN大鼠模型,随机分为模型组,氧化三甲胺组,糖络宁低、高剂量组,连续给药12周。采用苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠坐骨神经病理学改变,免疫荧光染色法检测大鼠坐骨神经中p-PERK,磷酸化的真核翻译起始因子2a（p-eIF2a）和转录活化因子4（ATF4）蛋白的表达;建立高糖诱导的雪旺细胞模型,分为25 mmol·L^-1葡萄糖组（control）,150 mmol·L^-1葡萄糖组（model）,150 mmol·L^-1葡萄糖＋0.1%,1%和10%糖络宁组,分别干预24,48 h。采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测细胞中PERK,核转录因子E2相关因子2（Nrf2）,血红素加氧酶-1（HO-1）,B淋巴细胞瘤-2相关的X蛋白（Bax）和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）mRNA表达水平。结果：坐骨神经病理学改变：空白组大鼠坐骨神经有髓神经纤维的髓鞘结构完整致密,形态规则,排列整齐。模型组出现严重脱髓鞘现象,结构松散,形态不规则,排列紊乱。糖络宁组有轻微脱髓鞘现象,结构近似完整,形态近似规则。经积分吸光度统计,与空白组相比,模型组明显降低（P〈0.01）;雪旺细胞PERK,Nrf2,HO-1,Caspase-3和Bax mRNA表达水平,与空白组比较,同时相的模型组中PERK,Bax和Caspase-3 mRNA的表达明显升高（P〈0.05,P〈0.01）,与模型组比较,同时相的糖络宁3个含药血清剂量组中以上3个指标表达明显降低（P〈0.05,P〈0.01）,而Nrf2和HO-1 mRNA的表达明显升高（P〈0.05,P〈0.01）;坐骨神经中p-PERK,p-eIF2a和ATF4蛋白表达,与空白组比较,模型组蛋白表达量显著增加（P〈0.01）;与模型组比较,糖络宁组蛋白表达量显著减少（P〈0.01）。结论：糖络宁能够减轻坐骨神经组织的病理损伤,其防治DPN的作用机制可能与调节内质网应激时PERK相关途径包括抑制PERK/eIF2a途径同时促进PERK/Nrf2途径有关。

糖络宁对高血糖大鼠血清外泌体中miR-322和IRE1α-RIDD表达的影响

目的探讨糖络宁通过高血糖大鼠血清外泌体抑制细胞凋亡的机制。方法SD大鼠分为对照组、模型组和糖络宁(10.9 g/kg)组。除对照组外,其余组大鼠ip链脲佐菌素诱导高血糖大鼠模型。给药组大鼠ig药物,对照组和模型组大鼠ig等体积蒸馏水,1次/d,连续12周。给药结束后,收集大鼠血清,采用差异离心法提取血清外泌体,使用大鼠雪旺细胞RSC96内化外泌体,将RSC96细胞分别与对照组、模型组、糖络宁组的大鼠血清外泌体共培养24h。采用CCK-8法测定RSC96细胞活力;采用Western blotting法测定RSC96细胞中肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、磷酸化IRE1α(p-IRE1α)和蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase A6,PDIA6)蛋白表达;采用qRT-PCR法测定外泌体中miR-322 mRNA表达,RSC96细胞中miR-322、IRE1α及IRE1依赖性衰解(IRE1-dependent decay,RIDD)底物CD59、蛋白激酶D2(protein kinase D2,PKD2)、A类清道夫受体(scavenger receptor class A,SCARA)、蛋白水解酶D(peptidase D,PEPD)m RNA表达。结果与对照组比较,模型组血清外泌体数量显著增加(<0.01),外泌体及RSC96细胞中miR-322m RNA水平显著降低(<0.05、0.01),RSC96细胞活力显著降低(<0.01),RSC96细胞IRE1α蛋白和mRNA表达水平显著升高(<0.01),PDIA6蛋白表达水平显著降低(<0.01),RIDD底物CD59、PKD2、SCARA和PEPD m RNA表达水平显著降低(<0.01);与模型组比较,糖络宁组血清外泌体数量明显降低(<0.05),外泌体及RSC96细胞中mi R-322 m RNA水平显著升高(<0.05、0.01),RSC96细胞活力显著增加(<0.05),RSC96细胞IRE1α蛋白和mRNA表达水平显著降低(<0.05),PDIA6蛋白表达水平显著升高(<0.01),RIDD底物CD59、PKD2、SCARA和PEPD mRNA表达水平显著升高(<0.05、0.01)。结论糖络宁通过增加高血糖大鼠血清外泌体中miR-322 mRNA水平,从而抑制IRE1α-RIDD诱导的细胞凋亡。

糖络宁对高糖环境下雪旺细胞线粒体相关内质网膜的作用机制研究

目的:观察糖络宁含药血清对高糖环境下雪旺细胞(SCs)线粒体相关内质网膜(MAMs)的影响。方法:采用高糖环境培养48h的SCs(RSC96细胞株)模型,设立空白对照组、模型对照组、α硫辛酸(ALA)组、1%糖络宁组、10%糖络宁组。在电镜观察MAMs形态的基础上,采用免疫荧光标记法定量检测SCs中MAMs。梯度超速离心法分离MAMs,通过ELISA法检测MAMs上PKR样内质网激酶(PERK)的表达、Western Blot检测MAMs上线粒体融合蛋白2(Mfn2)的表达。结果:与空白对照组比较,模型对照组MAMs数量降低、PERK表达显著升高、Mfn2表达显著降低(P<0.01);与模型对照组比较,1%、10%糖络宁组MAMs数量均显著增加,PERK表达降低而Mfn2表达显著升高(P<0.01)。结论:糖络宁能够增加高糖环境下SCs中MAMs,与其增加Mfn2,降低PERK的表达有关。

芍药苷对高糖环境下雪旺细胞线粒体动力学的影响

目的观察芍药苷(PF)对高糖环境下雪旺细胞线粒体动力学的影响。方法选取大鼠雪旺细胞(RSC96细胞株)培养,分为空白对照组(Con,25 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,150 mmol/L葡萄糖)、PF 1μmol/L组(PF 1,150 mmol/L葡萄糖+1μmol/L PF)、PF 10μmol/L组(PF10,150 mmol/L葡萄糖+10μmol/L PF)、PF 100μmol/L组(PF 100,150 mmol/L葡萄糖+100μmol/L PF),各组药物干预48 h。透射电镜观察线粒体形态,包括融合、分裂、溶胀、破裂等。Mitotracker-green标记线粒体联合活细胞激光扫描共聚焦显微镜,定量分析线粒体动力学参数,包括线粒体网状结构的平均分支长度和平均分支数。Western blot测定线粒体融合蛋白1(Mfn1)、Mfn2、视网膜萎缩蛋白1(Opa1)及线粒体分裂的动力相关蛋白1(Drp1)蛋白表达。结果与Con组比较,HG组线粒体多呈球状,线粒体网状结构的平均分支长度和数量减少(P<0.01),Mfn1、Mfn2和Opa1蛋白表达降低(P<0.01),Drp1蛋白表达升高(P<0.01);与HG组比较,PF 1、PF10、PF100组线粒体多呈棍状,线粒体网状结构平均分支长度和数量增加(P<0.01),Mfn1,Mfn2和Opa1蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01),Drp1蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。结论 PF能促进高糖环境下雪旺细胞线粒体融合,降低分裂,维持线粒体动力学平衡,改善线粒体形态与功能,降低雪旺细胞凋亡。