人骨形态发生蛋白-2真核表达载体的构建

目的 构建人骨形态发生蛋白 - 2 (h BMP- 2 )真核表达载体 ,并观察其在真核细胞内表达的可能性。方法 Sal I和 Xba I双酶切含有 h BMP- 2全长 c DNA的 p U C19,回收 1.2 4kb片段 ,将其连入真核表达载体pc DNA3,构建重组子 pc DNA3- h BMP- 2。将重组子转化细菌 ,扩增后提取质粒 ,分别用 Eco R I和 Xba I双酶切和Xho I单酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定。将重组子转染成纤维细胞 ,G418筛选形成阳性克隆后继续培养 4周行细胞原位杂交和免疫组织化学染色。结果 琼脂糖电泳显示 :用 Eco R I和 Xba I双酶切后可形成两条带 ,大小分别为1.3kb和 5 .38kb,而 Xho I酶切位点消失 ,符合物理图谱 ,表明载体构建成功。转染后 G418筛选所获阳性克隆 ,继续培养 4周 ,细胞原位杂交和免疫组织化学染色 ,结果表明 h BMP- 2基因在 m RNA水平和蛋白水平均有表达。结论成功构建 h BMP- 2真核表达载体 ,该载体可在真核细胞内表达 。

pcDNA_3-hBMP_2基因转染成纤维细胞及其稳定表达

目的 探讨外源性hBMP2 基因在成纤维细胞获得稳定表达的可行性。 方法 将hBMP2 的cDNA连入真核表达载体pcDNA3 ,形成重组真核表达载体pcDNA3 hBMP2 ,在脂质体介导下 ,将其导入小鼠成纤维细胞株 (NIH3T3)。通过G418筛选获得阳性克隆 ,并继续培养 4周 ,然后用原位杂交和免疫组织化学方法检测BMP2 基因在成纤维细胞NIH3T3内的稳定表达情况。 结果 经原位杂交和免疫组织化学证实 ,转染pcDNA3 hBMP2 后的成纤维细胞NIH3T3内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达。 结论 在脂质体介导下 ,hBMP2