重组结核杆菌融合蛋白(EC)的免疫特性和临床前安全性研究

目的通过对重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)"](简称"EC")的免疫特性和临床前安全性研究,探讨其临床应用前景。方法(1)免疫特性研究:取6只雌性豚鼠,使用结核分枝杆菌H37Ra活菌菌液致敏,5周后,皮内注射2.5μg/ml EC原液0.2ml;取4只雌性豚鼠,使用卡介菌活菌菌液致敏,5周后,皮内注射20μg/ml EC原液0.2ml;观察注射部位平均硬结或红晕反应直径[(纵径+横径)/2],≥5mm判为阳性,<5mm判为阴性。(2)急性毒性试验:取80只ICR[(美国)Institute of Cancer Research]小鼠,分为单次肌内和皮内注射组,每组40只,雌雄各半;每组再分为4组,每组10只,雌雄各半。高剂量组(注射EC53.61μg/0.1ml)、低剂量组(注射EC 0.2μg/0.1ml)、溶剂对照组(注射EC稀释液0.1ml)、空白对照组(不给予任何受试物),观察小鼠的外观、运动功能、体质量、各脏器和药物注射部位皮肤等是否有异常。(3)豚鼠全身主动过敏试验:取豚鼠24只,分为4组,每组6只,雌雄各半,各组豚鼠分别隔日腹腔注射高剂量(5μg/kg)EC、低剂量(0.5μg/kg)EC、牛血清白蛋白(60mg)和0.9%NaCl(质量分数为0.9%的NaCl溶液)注射液(2ml),连续3次。致敏结束,末次致敏后第12天静脉快速注射2倍致敏剂量对以上相应的各组致敏豚鼠进行激发。致敏期间,每天观察豚鼠的症状,并于初次和最后一次致敏及激发当日测定每只豚鼠的体质量。(4)皮内刺激试验:取6只新西兰兔,单次皮内注射EC 10μg(0.2ml)/点,每侧5个点,观察皮内注射后的刺激反应情况。结果(1)免疫特性研究结果:EC原液对卡介菌活菌菌液致敏的4只豚鼠的皮肤试验,阳性为0只;EC原液对结核分枝杆菌H37Ra活菌菌液致敏的6只豚鼠的皮肤试验,阳性为6只。(2)急性毒性试验结果:所有小鼠未出现明显的急性中毒反应和显示急性中毒靶器官。小鼠皮内注射EC前、注射EC后1d、3d、5d、7d、8d、10d、12d、14d高剂量组、低剂量组小鼠平均体质量分别为(20.6±1.3)g^(24.9±2.1)g、(20.5±1.6)g^(26.0±3.1)g;注射后不同观察时间各组平均体质量与空白对照组[(21.0±1.1)g^(25.3±2.3)g]比较差异均无统计学意义(t值分别为0.571~0.392,0.695~0.615;P值分别为0.575~0.700,0.496~0.546);小鼠肌内注射EC前、注射EC后1d、3d、5d、7d、8d、10d、12d、14d高剂量组、低剂量组小鼠平均体质量分别为(21.0±1.5)g^(26.2±1.9)g、(20.5±2.1)g^(25.8±3.8)g;注射后不同观察时间各组平均体质量与空白对照组[(21.2±1.7)g^(25.8±3.1)g]比较差异均无统计学意义(t值分别为0.360~0.318,0.900~0.006;P值分别为0.723~0.754,0.380~0.995)。(3)豚鼠全身主动过敏试验结果:豚鼠无过敏反应。高剂量组、低剂量组豚鼠首次致敏、末次致敏、激发的平均体质量分别为(327.5±24.3)g、(347.2±32.7)g、(402.2±34.9)g;(331.3±26.7)g、(346.2±32.0)g、(411.3±38.9)g,与相应观察时间注射0.9%NaCl的阴性对照组[(329.5±27.4)g、(348.3±27.0)g、(399.4±25.4)g]比较,差异均无统计学意义(t值分别为0.328、0.181、0.284,0.474、0.366、0.875;P值分别为0.757、0.864、0.788,0.656、0.730、0.422)。(4)兔皮内刺激试验结果:单次皮内注射10μg(0.2ml)/点EC,无明显刺激反应。结论EC能够鉴别结核感染与卡介苗免疫,临床前动物试验安全性好,有望应用于人群结核感染的诊断与鉴别诊断。

重组结核杆菌融合蛋白(EC)产品质量标准的建立

目的建立重组结核杆菌融合蛋白(EC)[该制品名称是国家药典委员会确定的药品中文通用名称,"EC"为重组融合蛋白"结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)";简称"EC"]原液及成品的质量标准。方法选取6批次EC原液及11批次EC成品、体质量300~400g无特定病原体(SPF)级白色豚鼠21只、卡介苗(BCG)活菌菌液(1mg/ml)、结核分枝杆菌减毒株H37Ra活菌菌液(2mg/ml)作为实验材料,建立EC原液质量标准,包括残余抗生素活性检测、致敏效应实验、效价测定及动物法鉴别实验;建立EC成品质量标准,包括鉴别实验及效价测定;应用建立的质量检测标准对连续6批次EC原液和11批次EC成品进行检测,验证其适用性和可行性。结果(1)EC原液残余抗生素活性检测。①专属性实验:磷酸盐缓冲液的吸光度值(A值)为1.736,卡那霉素标准品(0.0ng/ml)的A值为2.178;②线性与范围实验:卡那霉素标准品在0.5~40.5ng/ml范围内,连续3次实验回归方程拟合优度的判定系数R^2均大于0.99;③准确性实验:连续3批次EC原液的卡那霉素残留量回收率分别为112.163%、117.285%、103.527%;④重复性实验:连续3批EC原液重复性实验A值相对标准偏差(RSD)分别为5.59%、9.18%、8.07%;⑤中间精密度实验:同一实验员不同时间及不同实验员检测连续3批次EC原液卡那霉素残留量检测均小于定量限0.5ng/ml,为限量测定;⑥耐用性实验:改变读板时间(0、5、10min)对EC原液卡那霉素残留量检测无影响,卡那霉素残留量均小于定量限0.5ng/ml。(2)EC原液效价测定:稀释度为1μg/ml(5U/ml)、2.5μg/ml(12.5U/ml)、5μg/ml(25U/ml)及10μg/ml(50U/ml)时,每个稀释度对应的2批次EC原液动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径及硬结或红晕平均直径总和比值分别为(15.17±0.88)mm、(13.67±1.25)mm、1.11(91.00/82.00);(17.00±1.76)mm、(16.08±1.32)mm、1.06(102.00/96.50);(19.58±1.69)mm、(17.67±1.37)mm、1.11(117.50/106.00);(20.75±1.57)mm、(20.25±1.17)mm、1.02(124.50/121.50)。(3)EC原液动物法鉴别实验:连续3批次EC原液动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径均为0,TB-PPD动物皮肤试验的硬结平均直径为(15.13±5.06)mm。(4)EC成品鉴别试验:连续3个批次EC成品动物皮肤试验的硬结或红晕平均直径均为0,TB-PPD动物皮肤试验的硬结平均直径为(16.50±2.65)mm。(5)质量标准验证:①EC原液:残余抗生素活性检测结果均低于定量限0.5ng/ml;致敏效应实验结果均为皮肤试验后豚鼠注射部位局部反应无明显区别,也无全身反应;每个稀释度[2.5μg/ml(12.5U/ml)、5μg/ml(25U/ml)及10μg/ml(50U/ml)]在皮内注射后24h所产生的局部硬结或红晕反应平均直径均≥8mm,与相应稀释度参考品的局部硬结或红晕平均直径总和的比值为0.9±0.1;动物法鉴别实验结果为EC原液对BCG活菌致敏组豚鼠的皮肤试验结果均呈阴性反应(硬结或红晕平均直径<5mm),而TB-PPD呈阳性反应(硬结平均直径≥5mm)。②EC成品检测:各批次成品对BCG活菌致敏组豚鼠的皮肤试验均呈阴性反应(硬结或红晕平均直径<5mm),而TB-PPD呈阳性反应(硬结平均直径≥5mm)。结论所建立的质量标准可用于EC原液及成品的检定。