大鼠坐骨神经再生过程中的神经元轴突自噬作用(英文)

目的探讨大鼠坐骨神经变性轴突清除中的自噬作用.方法横切大鼠坐骨神经制作Wallerian变性模型,造模后不同时间点取远断端组织行电镜结构观察和酸性磷酸酶(AcPase)活性检测.结果坐骨神经横切后轴突发生变性,主要变化为术后第5小时～2天轴质肿胀,轴突与髓鞘分离,术后第4天轴质浓缩,轴突与髓鞘完全分离形成游离轴突体.术后初期变性轴突主要形成大小不等的空泡,后期轴突与髓鞘完全分离并形成较大的游离轴突体,轴突体外包一层轴突膜是神经元细胞膜的延续,轴突体轴质浓缩,含大量各级自噬泡和纵横交错的神经丝、微管和微丝.经酸性磷酸酶(AcPase)染色证实自噬泡均呈AcPase阳性,第7天后轴突体被降解吸收,形成的空腔内偶见巨噬细胞.结论大鼠坐骨神经再生过程中变性轴突的清除主要靠轴突自身的自噬和施万细胞吞噬机制,而巨噬细胞只起辅助作用.

大鼠坐骨神经再生过程中的神经元轴突自噬作用

目的:探讨大鼠坐骨神经变性轴突清除中的自噬作用。方法:横切大鼠坐骨神经制作wallerian变性模型,造模后不同时间点取远断端组织行电镜结构观察和酸性磷酸酶(AcPase)活性检测。结果:坐骨神经横切后轴突发生变性,主要变化为术后第5h～2d轴质肿胀,轴突与髓鞘分离,术后第4d轴质浓缩,轴突与髓鞘完全分离形成游离轴突体。术后初期变性轴突主要形成大小不等的空泡,后期轴突与髓鞘完全分离并形成较大的游离轴突体,轴突体外包一层轴突膜是神经元细胞膜的延续,轴突体轴质浓缩,含大量各级自噬泡和纵横交错的神经丝、微管和微丝。经酸性磷酸酶(AcPase)染色证实自噬泡均呈AcPase阳性,第7d后轴突体被降解吸收,形成的空腔内偶见巨噬细胞。结论:大鼠坐骨神经再生过程中变性轴突的清除主要靠轴突自身的自噬和施万细胞吞噬机制,而巨噬细胞只起辅助作用。

大鼠坐骨神经再生过程中的施万细胞自噬作用

目的探讨大鼠坐骨神经再生过程中的细胞自噬作用。方法横切大鼠坐骨神经制作wallerian变性模型,分别于造模后0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4、5、7、10、15 d取远断端组织行电镜结构观察。结果轴突在第0.5天时从髓鞘脱离,溃变呈空泡状。第2天开始髓鞘皱褶、断裂形成碎片,神经膜细胞(Schwann cell, 施万细胞)内见大的膜结合髓鞘碎片和许多散在小碎片,并与溶酶体融合形成自噬泡,呈酸性磷酸酶(AcPase)阳性。第4天时内膜区偶见幼稚细胞,1周后见大量幼稚细胞。第7天后施万细胞内自噬泡数量开始减少。实验全程偶见巨噬细胞,内有吞噬泡。结论大鼠坐骨神经再生过程中溃变髓鞘主要经施万细胞自噬清除,施万细胞脱分化为施万细胞祖细胞后大量增殖分化参与神经再生过程。

生物可吸收高强度左旋聚丙交酯材料在体内的力学特征

目的：观察生物可吸收固态压缩法增强的、高强度左旋聚丙交酯(ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌａｃｔｉｄｅ，ＰＬＬＡ)材料在体内的力学变化特征，评价其作为骨固定装置材料的价值。 方法：用特殊的加热压缩方法－固态压缩法（ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ＳＣ）加工左旋聚丙交酯，得ＳＣ－ＰＬＬＡ试棒（３．２ｍｍ×３０ｍｍ），植入兔的皮下和股骨内，在长达４８周的降解时间里，观察材料的力学性能（弯曲强度和剪切强度）和扫描电镜（ＳＥＭ）下的微观形态。 结果：植入２４周后，各组ＳＣ－ＰＬＬＡ在体内的力学强度均可维持在弯曲强度１８０Ｍｐａ以上，剪切强度７５Ｍｐａ以上，它们都大于皮质骨强度。剪切强度的下降比弯曲强度快。ＳＥＭ见ＳＣ－ＰＬＬＡ降解前内部有大量排列整齐的纵向纤维，并随降解而破坏并出现孔隙。 结论：固态压缩法可获得高初始强度和维持强度的ＰＬＬＡ，满足一般的骨内固定要求。ＳＣ－ＰＬＬＡ是一种有前途的生物可吸收接骨材料。

生物可吸收高强度固态压缩聚丙交酯的降解特征和强度维持

用特殊的加热压缩方法固态压缩法 (solid statecompression ,SC)加工左旋聚丙交酯 (poly L lac tide ,PLLA) ,获得高强度SC PLLA(弯曲强度 2 5 0Mpa,剪切强度 190Mpa)。将SC PLLA棒 (3.2mm× 30mm) ,置于PBS液或植入兔的皮下和股骨内 ,定期观察粘均分子量、结晶度、扫描电镜 (SEM )形态和机械性能 (弯曲强度和剪切强度 ) ,研究该材料的降解特征和强度特性 ,以评价其作为矫形外科骨固定装置材料的价值。结果表明 ,各组分子量在前 12周下降迅速 ,其后缓慢下降 ,至 72周时 ,各组分子量降解 98%以上 ;结晶度则与此相反 ,12周内上升迅速 ,36周达最大。SEM见SC PLLA降解前内部有大量排列整齐的纵向纤维 ,并随降解而破坏并出现孔隙。SC PLLA降解 2 4周后 ,各组的弯曲强度仍维持在 180MPa以上 ,剪切强度在 75MPa以上 ,都大于皮质骨强度 ,提示材料的强度维持时间满足一般的骨内固定要求。因此SC

细胞内F-actin的聚合与解聚对肝癌Bel-7402细胞的影响

目的 :为探讨癌细胞内F actin的解聚与聚合对癌细胞的形态、迁移、侵入的影响。方法 :利用激光共聚焦显微镜对贴附培养的人肝癌Bel 74 0 2细胞形态及其细胞内F actin进行观察 ;使用流式细胞仪对贴附的Bel 74 0 2细胞及其脱落细胞与Cyt B处理后Bel 74 0 2细胞内F actin的含量进行分析。结果 :Bel 74 0 2细胞在培养的过程中 ,癌细胞形态伸展 ,出现侵入性生长 ,细胞内F actin聚合形成粗大的贯通细胞内的F actin束 ,F actin含量增高 ;癌细胞在生长过程中 ,常出现重叠生长 ,细胞变圆 ,F actin解聚变短 ,F actin小体增高 ,细胞有脱落的趋势 ,其脱落细胞内的F actin含量低于贴附细胞。结论 :人肝癌Bel 74 0 2细胞内F actin的聚合可增加癌细胞的贴附和侵入性 ;细胞内F actin的解聚 ,及G actin重新聚合形成F

坐骨神经离断后组织型纤溶酶原激活物对脊髓神经细胞的影响

目的 : 探讨坐骨神经损伤后组织型纤溶酶原激活物 (tPA)对脊髓神经细胞的影响及其作用机制。 方法 :切断SD大鼠一侧坐骨神经 ,取损伤后 0、1、2、4、7和 14天的大鼠脊髓L5～L6节段 ,行石蜡包埋后对其中的tPA、凋亡蛋白 (Bax)进行免疫组化检测 ,用激光共聚焦对tPA在脊髓中的分布及变化规律作进一步分析 ,RT PCR技术对L5以下节段伤侧脊髓中tPA和Bax的mRNA水平进行检测。 结果 :tPA和Bax在蛋白和基因水平变化呈明显的时间、空间相关性。 结论 :坐骨神经损伤后神经元和神经纤维可释放一定量的tPA ,而这些tPA释放的级联放大作用可能是引起神经元死亡的始动原因之一。

大鼠坐骨神经再生过程中许旺氏细胞的自噬作用(英文)

背景:Wallerian变性时髓鞘溃变碎片的清除对于神经的再生至关重要,但溃变碎片的清除机制一直没有彻底阐明,关于参与清除的细胞成分类型仍有很大争议。目的:探讨大鼠坐骨神经再生过程中许旺氏细胞的自噬作用。设计:完全随机自身对照研究。地点和对象:本实验由第一军医大学解剖教研室、汕头大学医学院中心实验室和西南大学达拉斯医学中心精神病学部共同完成,研究对象为成年Wistar大鼠30只,雌雄各半,体质量180-250g。干预:横切大鼠坐骨神经制作Wallerian变性模型,分别于造模后0,0.5,1,1.5,2,3,4,5,7,10,15d取远断端组织行电镜观察。主要观察指标:电镜观察轴突和髓鞘的超微结构,Gomori染色后检查酸性磷酸酶活性。结果:轴突在第0.5天时从髓鞘脱离,溃变呈空泡状。第2天开始髓鞘皱褶、断裂形成碎片,许旺氏细胞内见大的膜结合髓鞘碎片和许多散在小碎片,并与溶酶体融合形成自噬泡,呈酸性磷酸酶(AcPase)阳性。第4天时内膜区偶见幼稚细胞,1周后见大量幼稚细胞。第7天后许旺氏细胞内自噬泡数量开始减少。实验全程偶见巨噬细胞,内有吞噬泡。结论:大鼠坐骨神经再生过程中溃变髓鞘主要经许旺氏细胞自噬清除,许旺氏细胞脱分化为许旺氏细胞祖细胞后大量增殖分化参与神经再生过程。

大鼠坐骨神经切除后人发角蛋白诱导的神经的再生机制

目的观察人发角蛋白(HHK)诱导坐骨神经再生时的形态学变化,以揭示神经再生机制。方法制备坐骨神经损伤动物模型,植入HHK丝束桥接体,于术后2天、1、2、3、6、9、12周进行组织学观察。结果术后第2天到2周,大量新生微血管长入HHK植入部位,切除后近远端的施万细胞发生去分化。去分化后的施万细胞沿着HHK丝束表面纵向分裂增殖。术后第3周人发开始降解,HHK周围可见很多巨噬细胞和多核巨细胞,大量增生的施万细胞有规则地排列于HHK丝间,有轴突和大量的微血管出现。术后第6周,在HHK丝周围可见大量新生的神经纤维,其间有微血管分布。术后第9周,人发角蛋白降解显著,再生神经纤维增多,有明显的神经外膜和束膜。术后第12周,实验组人发角蛋白基本完全降解,其部位被新的神经纤维所取代,并已贯通缺损部位,且外观形态接近正常神经。结论1、HHK对缺损的坐骨神经修复具有良好的桥接作用。2、受损后高度分化的施万细胞通过去分化形成幼稚的施万细胞,其中胞质脱落起着关键作用。3、受损轴突立即发生保护性封闭、脱落。健康轴突形成膨大的带突起的生长锥,生长锥突起上伸出许多丝状生长芽,并与1到多个施万细胞嵌合,它们通过竞争性选择,最后只有一条生长芽可发育成完整的轴突。4、神经纤维屏障膜(神经外膜、束膜及内膜)是由最外侧的血管屏障膜中和束内的微血管间充质细胞演变而成的。总之,施万细胞、神经轴突、神经膜三者的再生模式是自身器官化过程所要求的,它们是同步进行的协调行为。

用免疫荧光标记对人组织中肥大细胞亚型的分选与形态观察

方法:利用中性蛋白酶成分、特征性酶抗体的免疫荧光染色和流式细胞仪确定分选肥大细胞亚型,以激光扫描共聚焦显微镜显示肥大细胞内分泌颗粒。结果:三种免疫表型被确定:肥大细胞的类胰蛋白酶阳性(MCT)、类糜蛋白酶阴性;类糜蛋白酶阳性(MCC)、类胰蛋白酶阴性和类胰蛋白酶阳性、类糜蛋白酶阳性(MCTC)。肥大细胞内分泌颗粒分散或聚集存在,分泌颗粒突起分泌或以分散的方式释放。分泌颗粒大范围释放后,肥大细胞的形态结构发生了改变。结论:利用肥大细胞的特征性酶抗体、免疫荧光标记和流式细胞仪可将人组织中的肥大细胞分选纯化为三种亚型;以共聚焦显微镜显示肥大细胞含有丰富的分泌颗粒,它说明肥大细胞具备了为人体I型变态反应提供快速反应的物质基础。

抑制性消减杂交法筛选植入人发角蛋白与单纯脊髓损伤大鼠基因表达的差异

目的:采用抑制性消减杂交筛选植入人发角蛋白大鼠损伤脊髓基因性差异表达。方法:实验于2004-11在汕头大学中心实验室进行。分别从植入人发角蛋白损伤组与单一损伤对照组4thw组织中提取mRNA,反转录成双链cDNA,经RsaI酶切、接头连接、两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链扩增,而后将消减cDNA产物进行T/A克隆和测序分析。结果:所获植入人发角蛋白脊髓损伤组织差异表达基因的消减cDNA产物散布在280～800bp范围。经蓝白筛选和酶切鉴定,共得到232个阳性克隆。对其中20个做测序分析获得了氨基酸转运蛋白系统A2(Ata2)、细胞色素氧化酶Ⅲ(COXⅢ)、抗过氧化物蛋白5(Prd5)、Tap1蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cst3)等5个表达蛋白。结论:prd5、Ata2和COXⅢ分别通过参与脊髓损伤后抗氧化损伤过程,起到抑制自由基、兴奋性氨基酸的产生,减轻Ca离子紊乱的程度,降低了继发性损害对脊髓组织的二次损伤程度;而Tap1蛋白和Cst3则参与人发角蛋白的降解过程。

感染冠状病毒的大鼠胸腺组织超微结构观察

目的通过对感染大鼠冠状病毒(rat coronavirus,RCV)的大鼠胸腺组织进行超微结构的研究,阐明RCV在细胞内形成的形态学机制.方法用在进行自噬性形态学研究中的Wistar大鼠做模型,常规电镜取材、固定、包埋、切片和观察.结果胸腺上皮细胞的胞质内出现大小不等的内质网池,并相互融合形成巨大的内质网湖,湖内充满RCV颗粒,称为病毒包涵体.病毒在内质网囊壁上通过出芽方式进入内质网湖基质,发育为成熟的RCV,最终排出于细胞外.病毒颗粒呈圆形,直径约100～130 nm.病毒胞浆成均质状,病毒的膜蛋白有二层,外层为包膜,内层为核衣壳.包膜与核衣壳之间为低电子密度的中间层,其内有时可见1～2层较薄的膜样结构.钉突成放射状贯穿包膜,其内侧端连于核衣壳,外侧端膨大,由一层絮状的糖蛋白包绕,形成日冕状.病毒颗粒分布在胸腺上皮细胞的内质网湖、胞浆、内吞体/溶酶体以及胸腺上皮细胞间,溶酶体内的病毒无包膜和核衣壳.结论内质网湖参与RCV包膜的形成,从细胞外侵入的RCV均在内吞体/溶酶体内脱去包膜和核衣壳,脱下的包膜和核衣壳被其降解,而RCV在胸腺上皮细胞基质中进行复制.在胸腺细胞内未见有RCV.

人食管癌细胞株PTEN的激光共聚焦扫描显微镜检测

目的 对人胚食管上皮永生化细胞株SHEE、SHEEMT、食管癌细胞株EC8712中PTEN表达情况进行定量比较和定位观察。方法 采用激光共聚焦扫描显微镜光学切片和荧光探针的双重标记技术对三株细胞中PTEN的表达和分布情况进行检测。结果 人食管癌细胞中PTEN主要表达在细胞浆和细胞核 ,在人胚食管癌上皮永生化细胞株SHEE、SHEEMT主要表达在细胞浆 ,食管癌细胞EC8712中细胞核表达增多 ,差异有统计学意义 (P <0 0 1) ;PTEN在三种细胞株中表达强弱顺序为SHEE >SHEEMT >EC8712 ,差异有统计学意义 (P <0 0 1)。结论 PTEN在SHEE、SHEEMT和EC8712分化程度不同的细胞株中均表达 ,表达和分布位置与分化程度相关。

流式细胞仪分析癌细胞对肥大细胞募集的影响

目的:研究食管癌细胞迁移到小鼠腹腔时肿瘤细胞周边微环境的变化。方法:将食管癌细胞株EC109和/或诱导试剂植入小鼠腹腔,利用组织化学的方法、荧光标记的肥大细胞蛋白酶和流式细胞术,我们在小鼠模型观察肠组织的形态和腹腔的MC亚型的变化。结果:胰酶导致小鼠肠道平滑肌层和黏膜下层的组织增厚,细胞间隙的增加可能有益于MC在组织移动或迁移进入腹腔;它引起小鼠腹腔液的总MC增加,MCC亚型的相对比例增加,MCT亚型减少。EC109细胞不能明显地改变小鼠肠道组织的形态,但它显著地引起腹腔MCT亚型的相对比例增加。结论:根据肥大细胞内颗粒的类胰蛋白酶和类糜蛋白酶的差异表达,可证实小鼠的MC亚型;并且不同的诱导物可能影响腹部微环境的变化。目前的研究表明,食道癌细胞可以诱导MCT(含有类胰蛋白酶)亚型迁移到小鼠腹腔,造成肿瘤细胞周围的内部环境的变化。

抑癌基因PTEN在鼻咽癌细胞株中表达的研究

目的:检测人鼻咽癌细胞株中PTEN表达情况,探讨鼻咽癌细胞中PTEN表达与细胞分化程度的关系。方法:进行细胞株的培养,采用流式细胞仪和共聚焦显微镜检测方法对细胞中PTEN的表达进行定位定量检测。结果:两种细胞株均有PTEN的表达,表达强度和分布与分化程度有关,分化越好,表达越高,流式细胞仪检测PTEN在细胞株中表达强弱顺序为CNE1>CNE2,阳性表达细胞数CNE1>CNE2差异有统计学意义(P<0.01);激光共聚焦扫描显微镜检测PTEN主要表达在细胞核和细胞浆,分布与分化程度有关,细胞核表达强度CNE1<CNE2,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:PTEN在鼻咽癌细胞株中表达和分布与细胞株的分化程度有关。

双重免疫胶体金标记组织中肥大细胞内分泌颗粒的超微结构

目的:观察肥大细胞分泌颗粒内特异性酶的分布及其超微结构,并探讨肥大细胞的功能。方法:用双重免疫胶体金标记类胰蛋白酶抗体(AA5)及类糜蛋白酶抗体(CC4),在透射电子显微镜下观察肥大细胞内分泌颗粒的超微结构。结果:在肥大细胞内分泌颗粒中富集类胰蛋白酶和(或)类糜蛋白酶,多数酶蛋白呈细小球形结构;在细胞膜内侧分泌颗粒融合形成分泌通道,细胞的外侧可见肥大细胞脱出的颗粒;细胞内的另侧分泌颗粒呈球形小泡。结论:肥大细胞内酶蛋白的富集可为肥大细胞参与Ⅰ型变态反应提供物质基础。

组织中肥大细胞内F-actin对其不同亚型细胞分泌作用的影响

目的：研究细胞内丝状肌动蛋白的变化对不同亚型肥大细胞分泌作用的影响。方法：利用肥大细胞的特征性蛋白酶抗体和鬼比环肽的免疫荧光标记；以流式细胞仪检测分选人皮肤组织中肥大细胞的亚型；使用激光扫描共聚焦显微镜显示肥大细胞内分泌颗粒和微丝的分布。结果：类胰蛋白酶免疫反应性的肥大细胞内含有丰富的丝状肌动蛋白环，在质膜内层区域形成阻碍类胰蛋白酶释放的屏障；大量的类胰蛋白酶暂存于分泌泡中，少量的类胰蛋白酶因细胞内丝状肌动蛋白环的解聚使之从分泌泡中释放。而类胰蛋白酶和类糜蛋白酶免疫反应性的肥大细胞及类糜蛋白酶免疫反应性的肥大细胞内少见或未见明显的阻碍蛋白酶释放的丝状肌动蛋白环；细胞形态膨胀，细胞内蛋白酶已释放。结论：人皮肤组织中肥大细胞内类胰蛋白酶和／或类糜蛋白酶的含量及其肥大细胞亚型与丝状肌动蛋白环相关联。

食管癌患者手术前后免疫功能改变对外周血细胞凋亡的影响

为探讨食管癌手术前后患者外周血细胞的凋亡情况。利用流式细胞仪对70例食管癌手术前及其手术后10天～14天患者外周血细胞的DNA和CD4，CD8和CD16／56含量进行了分析。结果显示：手术前后患者外周血细胞的凋亡有差异（P〈0．05），但血细胞的DNA合成期细胞比率（S-phage fraction，SPE）、细胞增长指数无明显的差异（P〉0．05）。两组的CD4／CD8比值或CD16／56比例有明显差异（P〈0．001）。实验数据表明：手术前患者的细胞凋亡增加可能有利于平衡肿瘤细胞的恶性增殖；而外周血细胞的CD8、NK（自然杀伤细胞，natural killer cells）增高，可能有助于这种平衡作用。但手术后患者肿瘤负荷减轻，免疫功能恢复常态，细胞凋亡率相应降低。

小鼠巨噬细胞内游离钙离子变化介导的吞噬作用(英文)

为评估小鼠巨噬细胞吞噬死亡细胞时胞质内游离钙离子的变化。实验使用F luo-3标记巨噬细胞内钙离子和碘化丙碇对死亡细胞核染色,观察吞噬过程中细胞内钙离子的变化和显示巨噬细胞的吞噬功能,检测含死亡细胞的巨噬细胞内荧光密度图像。利用激光扫描共聚焦显微镜检测钙离子的释放。在缺钙的溶液中,可见巨噬细胞接触死细胞时细胞内钙离子快速地聚集和增高。在吞噬体形成时,巨噬细胞内钙离子上升到较高的水平。快速上升后,当吞噬小泡消化时,细胞内游离钙下降,随后钙离子恢复到低水平。研究显示伴随着吞噬小泡中红色荧光的死细胞的出现和消失,巨噬细胞内出现一系列钙离子变化的图像。提示巨噬细胞内钙离子改变在细胞吞噬作用中具有一定的作用。

生长分化因子5基因原核表达质粒构建和表达及其体内成软骨的诱导活性

背景:生长分化因子5在软骨、四肢和关节的发育、形成中起着重要作用,是目前最常应用的研究早期关节发育的标志分子。克隆人生长分化因子5基因可为软骨、关节缺损的修复奠定研究基础。目的:利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人生长分化因子5成熟肽,探讨重组蛋白的体内诱导活性。设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2006-01/06在南方医科大学分析测试中心完成。材料:人流产胚胎膝关节区软骨组织取自解放军广州军区总医院妇产科,标本获取征得家属同意。10只KM小鼠购自南方医科大学实验动物中心,雌雄各半,体质量18～22g,6～8周龄。方法:通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胚胎软骨组织克隆生长分化因子5完整成熟肽基因,将所得基因片段插入pET22b(+)载体构建重组原核表达载体pET22b(+)-GDF5,重组质粒转化大肠杆菌BL-21进行IPTG诱导表达。凝胶介质镍离子螯合法纯化目的蛋白,植入小鼠后肢股部肌袋内常规苏木精-伊红染色进行生物学活性鉴定。主要观察指标:琼脂糖凝胶电泳观察目的基因表达条带,测序观察目的基因序列,SDS-PAGE电泳观察目的蛋白表达条带,组织学观察生长分化因子5诱导活性。结果:RT-PCR产物长约350bp,阳性克隆质粒经双酶切可切出约350bp的片段,测序表明与Genbank中的序列完全一致。SDS-PAGE电泳显示重组子转化菌在相对分子质量14100位置处出现特异外源蛋白表达带,和成熟肽相对分子质量13600接近。纯化后体内植入实验组织切片显示,大量的间充质干细胞聚集和增生,并分化成为成软骨细胞,分泌软骨基质并埋入其中变为软骨细胞。结论:通过RT-PCR法从人胚胎软骨组织中成功克隆出人生长分化因子5完整成熟肽基因,可在大肠杆菌中得到高效表达,经纯化后在动物体内具有成软骨诱导活性。