山羊血管紧张素转换酶2基因的克隆表达与生物信息学分析

[目的]血管紧张素转换酶2（ACE2）是RAS系统的关键调控酶,在动物上的研究较少,本试验研究了山羊ACE2的相关理化性质和功能。[方法]利用同源克隆及RT-PCR技术,根据牛的ACE2基因mRNA序列设计引物,从山羊肾脏组织中扩增出ACE2基因编码区的特异性片段,TA克隆到p MD19-T载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对生长出的单菌落进行验证后测序分析。根据测序分析结果设计引物,经PCR扩增和酶切连接,构建原核表达载体p ET-28a-ACE2,经过验证后转化大肠杆菌BL21（DE3）并用IPTG诱导表达ACE2蛋白。[结果]山羊ACE2基因c DNA编码区共包括2 415个核苷酸,编码804个氨基酸残基。同源性比对发现,山羊ACE2基因核苷酸序列同源性与绵羊ACE2最高,为99%,与斑马鱼最低,仅为60%。遗传进化分析也表明该ACE2基因与绵羊的遗传距离最近,与斑马鱼处在两个不同的分支上。蛋白结构及理化性质分析预测该山羊ACE2蛋白属于稳定型蛋白,蛋白信号肽序列位于第1氨基酸（aa）~18氨基酸（aa）之间,蛋白跨膜螺旋预测为Ⅰ型跨膜蛋白。成功构建山羊ACE2蛋白胞外部分（19~738 aa）表达载体,表达出的蛋白相对分子质量约为90×10^3,主要以包涵体的形式在BL21（DE3）中表达。[结论]本试验首次成功克隆了山羊ACE2基因编码区（基因序列号：KF921008.1）,并对其蛋白结构及理化性质进行了初步预测,同时在大肠杆菌中高效表达了其胞外区蛋白。

热应激造成奶牛乳腺上皮细胞损伤并影响乳合成相关载体的基因表达

本试验以奶牛乳腺上皮细胞为模型,旨在寻找热应激下调奶牛泌乳功能的相关因素。42℃高温处理奶牛乳腺上皮细胞0、0.5、1、1.5、2、4、8及12h,检测其对细胞活率,线粒体膜电位,热休克分子及蛋白基因、氧化应激相关基因以及氨基酸和葡萄糖转运载体基因表达的影响。结果显示,不同时间热处理显著降低乳腺上皮细胞活率（P〈0.05）,损伤细胞线粒体膜电位。HSP27基因表达显著下降（P〈0.05）,HSP70基因表达显著上调（P〈0.05）,HSP90基因表达在前4h显著上调（P〈0.05）,后恢复至正常水平,HSF-1基因表达在某些时间点显著上调（P〈0.05）。氧化应激相关基因Keach样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）表达无显著变化（P〉0.05）,核因子E2相关因子2（Nrf2）表达显著上调（P〈0.05）,NAD（P）H脱氢酶醌-1（NQO1）表达显著上调（P〈0.05）。跨膜氨基酸转运载体SLC7A7基因表达在1h和4h显著上调（P〈0.05）。葡萄糖转运载体GLUT1及GLUT8基因表达显著下调（P〈0.05）。葡萄糖转运载体GLUT12在热处理0~2h表达显著上调,4~12h显著下调（P〈0.05）。热应激能够显著降低奶牛乳腺上皮细胞活率,引起氧化应激,改变热休克蛋白和分子及跨膜转运载体的基因表达。

添加复合缓冲剂对高精料饲喂泌乳奶山羊乳品质的改善及机制

目的:探讨复合缓冲剂对高精料饲喂泌乳期奶山羊乳品质及机体健康状态的影响。方法:选取8只体质量接近的泌乳中期萨能奶山羊,随机分为高精料组(high concentrate diet group,HG)(精粗质量比60∶40)和缓冲剂组(buffering concentrate group,BG)(高精料中添加复合缓冲剂)。实验共20周,每周统计奶山羊产乳量,每周检测乳成分含量;至第19周,采集瘤胃液和血液样品,测定瘤胃液p H值及脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)含量及血液中相关生化指标。结果:与HG相比,BG的奶山羊平均日产乳量、乳中乳蛋白率、乳脂率及乳糖含量都高于HG,其中乳脂率显著高于HG(P<0.05)。HG奶山羊瘤胃p H值一直低于BG,且出现了亚急性瘤胃酸中毒症状,其中瘤胃液中LPS含量极显著高于BG(P<0.01);生化指标检测结果显示:HG奶山羊血液中碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性都高于BG,且差异显著(P<0.05)。结论:给泌乳奶山羊高精料饲料中添加复合缓冲剂可以改善泌乳期奶山羊乳品质和产乳量,其机理可能与复合缓冲剂缓解高精料所致的瘤胃p H值下降、减少代谢异常产物的产生,从而改善机体的健康状态有关。

动物外泌体的生物学功能研究进展

外泌体是指不同类型细胞分泌的由磷脂双分子层膜包裹蛋白质、脂质和核酸形成的囊泡结构,能够在细胞间转运蛋白质、脂质和核酸,是介导细胞间通讯的有力载体。外泌体天然存在于各种体液中,如血液、尿液、唾液、脑脊液和乳汁,为其广泛调控机体生理病理过程提供了基础。目前,外泌体在人类恶性肿瘤、自身免疫疾病等方面的研究已非常广泛,但其对动物生理病理调控方面的研究报道较少。近期研究表明,外泌体大量存在于各种哺乳动物的乳中,通过其内含miRNAs为幼畜提供免疫保护。因此,本文综述了外泌体的生成和来源、生物学功能及分离鉴定的方法,以期为其在畜牧学方面的研究提供参考依据。

低分子质量大豆肽对断奶仔猪胃酸分泌的影响及机制

目的:本实验旨在探讨大豆肽对断奶仔猪胃酸分泌的影响及其作用机制。方法:选取刚出生的健康苏姜猪仔猪30头,随机分为对照组和大豆肽组,对照组仔猪在断奶前常规补料,大豆肽组仔猪则补充基础日粮+2%大豆肽,仔猪在21 d时一次性断奶,分别在21日龄与35日龄时每组随机取6头仔猪宰杀,取血液、胃黏膜及胃内容物,对两组所有仔猪的胃食糜p H值、血清中胃泌素含量以及胃底组织中H+-K+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶、胃蛋白酶的活性进行测定。结果:大豆肽组中,21日龄仔猪胃内p H值下降(由对照组的4.40±0.17降至3.94±0.38),35日龄仔猪胃内p H值显著下降(由对照组的4.15±0.16降至2.89±0.06);35日龄仔猪血清中胃泌素含量显著升高(P<0.05),胃黏膜中H+-K+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶以及胃蛋白酶的活力均升高,但与对照组间无显著差异(P>0.05)。结论:大豆肽可促进仔猪胃酸分泌,但其作用途径不是通过提高H+-K+-ATP/Na+-K+-ATP酶活力通路实现,可能是通过促进胃泌素分泌直接作用于壁细胞引起的。

miRNAs对热应激畜禽调控的分子机制

热应激改变动物行为和生理机能,miRNAs作为22个核苷酸左右的非编码RNA,在转录后水平通过抑制靶基因参与机体的热应激调控。本文就miRNAs对热应激细胞生长、凋亡以及对热应激畜禽免疫、抗应激、器官损伤、生长性能和繁殖性能等方面所起作用及其机制进行综述。

热应激影响奶牛乳腺酪蛋白合成的机制

热应激不仅影响奶牛健康,同时影响奶牛泌乳性能和牛奶品质。乳蛋白作为影响牛奶品质的主要成分,其含量和产量受到基因、环境、内分泌激素等因素综合作用的影响。而现有关于热应激对奶牛乳蛋白含量及产量的影响的研究报道结果不相一致。因此,本文从热应激引起奶牛内分泌激素变化导致营养重分配的基因网络、乳蛋白合成的应答与转录调控机制改变层面,综述了其对奶牛乳腺酪蛋白合成的影响,为进一步的机理研究提供一些思路。

动物氨基酸转运与感知系统研究进展

氨基酸转运载体既有转运活性,又可作为感受器发挥胞外氨基酸感知功能。细胞膜上的氨基酸转运载体,尤其是转运大中性氨基酸包括亮氨酸的转运载体,能够通过胞内营养信号通路,包括调控细胞生长的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)通路以及被氨基酸饥饿所激活的一般性调控阻遏蛋白激酶(GCN)通路,调控细胞代谢。鉴于氨基酸转运载体的研究对动物营养学的重要性,本文对氨基酸转运载体的分类、氨基酸转运载体介导的氨基酸感知功能及氨基酸转运载体的组织特异性进行综述,以期更好的协助相关研究的发展。

热应激条件下粗饲料组合对奶牛氮素利用的影响

为了研究粗饲料组合对热应激奶牛氮素利用的影响,试验选取20头胎次和泌乳天数相似的健康荷斯坦奶牛,随机分成2组,每组10头,分别饲喂2种粗饲料组合饲粮:玉米青贮+苜蓿(0.92∶1.00,AF组)和玉米秸秆(CS组)。2组饲粮精料相同,精粗比均为63.7∶36.3。预试期1周,正试期8周。结果表明:1)与CS组相比,AF组奶牛产奶量及能量校正乳、4%脂肪校正乳、乳蛋白和乳糖产量显著或极显著升高(P<0.01或P<0.05)。2)奶牛对AF组饲粮粗蛋白质表观消化率极显著高于CS组(P<0.01)。3)与CS组相比,AF组瘤胃微生物蛋白产量显著升高(P<0.05),而尿液和血液尿素氮浓度极显著降低(P<0.01)。4)与CS组相比,AF组氮摄入量和乳中氮产量极显著升高(P<0.01),但氮转化效率显著降低(P<0.05)。结果提示,与玉米秸秆相比,玉米青贮+苜蓿的组合能提高饲粮粗蛋白质水平,增加热应激奶牛粗蛋白质表观消化率,促进瘤胃微生物蛋白和乳蛋白的合成,但氮的转化效率有待提高。

热应激通过诱导奶牛乳腺细胞凋亡减少乳蛋白

本试验旨在研究热应激时乳蛋白含量和产量降低与泌乳相关激素、乳蛋白合成相关信号通路及乳腺细胞凋亡的关系,并揭示热应激引起乳蛋白含量和产量下降的原因。选取4头泌乳日龄、体重、产奶量相近的经产健康荷斯坦奶牛作为试验动物。采取2×2交叉试验设计,试验共2期,每期18 d(其中预试期和试验期各9 d),2期之间间隔30 d。预试期为热中性环境,自由采食。试验期奶牛随机分为2组(n=2),分别为热应激组和配对限饲组。结果表明:1)热应激显著降低了乳蛋白的含量和产量(P<0.05)。2)热应激对酪氨酸激酶(JAK)-信号转导及转录激活因子(STAT)信号通路及κ-酪蛋白(CSN3)基因表达量没有显著影响(P>0.05)。3)热应激显著增加了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路中的m TOR的基因表达量(P<0.05),且有增加核糖体S6蛋白激酶(S6K1)基因表达量的趋势(0.05≤P<0.10)。4)热应激增加了乳腺细胞中与细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、环氧合酶-2(COX2)基因的表达量(P<0.05),且有增加B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(BAX)基因表达量的趋势(0.05≤P<0.10)。综合可知,热应激可能并不是通过调控单个乳腺细胞合成乳蛋白的能力来影响乳蛋白的含量和产量,而是通过诱导乳腺细胞的凋亡,减少可用于乳蛋白合成的乳腺细胞的数量来影响的。

外泌体的生物学功能及牛乳源性外泌体资源开发进展

外泌体是一种天然存在于动物体液中的纳米颗粒,能够包裹丰富的核酸、蛋白质和脂质等生物活性物质,是介导细胞间通讯的有力载体。牛乳源性外泌体可抵御摄入者或犊牛胃肠道消化酶的降解,将其包裹的活性内容物传递至靶器官发挥信号传递作用。近期研究表明,牛乳源性外泌体含有大量免疫相关RNA和蛋白质,可调控犊牛的生长发育,尤其是免疫系统的完善。然而,牛乳源性外泌体也可能通过其内含miRNA向人类引入新的病原体,增加巨大胎儿、肥胖、心血管疾病等一系列疾病发生的风险。因此,本文综述了外泌体的分子组成、分选机制、分离技术及其生物学功能,为进一步探索牛乳源性外泌体的潜在应用提供参考。

血管紧张素转化酶2和中性氨基酸转运载体BoAT1在不同日龄猪肠道中的表达差异

研究了肠道血管紧张素转化酶2(ACE2)和中性氨基酸转运载体B0AT1在不同生长阶段猪小肠各段中的分布表达,探讨其相互关系。研究选取3日龄仔猪、90日龄生长猪和120日龄成年猪十二指肠、空肠和回肠组织,采用体外扩增和荧光定量技术对各肠段组织中ACE2和B0AT1基因进行了定性和定量分析。结果显示ACE2基因在不同日龄猪小肠各段均有表达,相对表达量随日龄增长显著升高,120日龄猪表达量极显著上调。而肠道中B0AT1相对表达量逐渐下降,120日龄时显著下调。结果提示:ACE2在成年猪肠道组织中有较高表达,B0AT1在仔猪肠道组织中表达较高。