埃博拉病毒快速检测技术研究进展

埃博拉病毒(ebola virus,EBOV)是引起埃博拉病毒病(ebola hemorrhagic fever,EBHF)的病原体,属丝状病毒科。EBOV传染性强,致死率高;2014—2016年西非暴发埃博拉疫情共造成2.8万余人感染,1.1万余人死亡。早期、准确、灵敏的EBOV快速检测技术,可降低EBOV的传播风险。现从核酸检测及蛋白质检测技术两方面对EBOV快速检测的研究进展作一综述。

临床研究的医学伦理审查存在问题和改进措施

为保证临床研究学术论文的真实性和科学性,医学伦理审查是重中之重,但是目前医院、医学院校、科研院所和医学期刊编辑部对于医学伦理审查仍然不够重视,伦理问题仍然较为突出。本文将从医院、医学院校、科研人员和医学期刊编辑部等几方面对医学伦理审查方面存在的问题和改进措施进行综述。

沙眼衣原体荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立沙眼衣原体实时荧光定量PCR检测技术,以期用于沙眼衣原体的感染检测。方法针对沙眼衣原体ompA基因序列保守区域设计引物和TaqMan探针,构建标准质粒并制作标准曲线,建立沙眼衣原体实时荧光定量检测方法,通过对人型支原体等的检测评价方法的特异性。结果建立的沙眼衣原体荧光定量PCR体系能特异性检测沙眼衣原体,与人型支原体、解脲脲原体、淋球菌、大肠埃希菌EDL933、金黄色葡萄球菌无交叉反应;标准曲线在3.9×109～3.9×103 copies/μl之间线性关系良好(r2=0.99);方法的灵敏度高,检测最低拷贝数为3.9copies/μl;组内及组间变异系数均<5%。结论建立的检测沙眼衣原体实时定量PCR方法特异、灵敏,可用于沙眼衣原体感染的早期筛查和临床快速诊断。

登革病毒2型型特异性抗原片段的鉴定及其抗体ELISA检测方法的建立

目的筛选、鉴定登革病毒(Dengue virus,DENV)2型(DV2)型特异性抗原片段;建立优化检测DV2抗体的ELISA方法,并进行临床应用验证。方法采用生物信息学方法分析1~4型(DV1~DV4)及其相近虫媒病毒基因组序列,选择预测得分较高且在不同DV2流行株中高度保守的表位;利用pMal-c2x表达系统制备其原核表达抗原,Western blot法分析其免疫原性;建立优化检测DV2抗体的ELISA方法,并验证方法的特异性及灵敏性;应用优化的方法检测33份各型登革热(Dengue fever,DF)确诊患者及30份健康体检人群血清样本。结果经生物信息学分析,预测获得DV2特异性抗原表位12段,预测得分值较高的8段(E123~128、E131~135、E143~149、E223~229、E286~294、E340~347、E383~387及E391~398)重组表达载体经双向测序证实读码框架准确,经Western blot分析,包含抗原位点E143~149区域的融合表达片段D2Ag3仅与DV2多克隆抗体发生免疫反应。ELISA优化条件为抗原包被浓度2μg/mL,4℃包被24 h,37℃封闭2 h;经该方法分析,D2Ag3原核表达抗原与DV2多克隆抗体反应的A450≥1.37,与其他20种多克隆抗体反应的A450均≤0.04,DV2多克隆抗体在40~20480倍稀释范围内,均可获得阳性检测结果。63份临床阳性样本A450>0.32,阴性样本A450<0.12,检测样本/阴性对照比值(sample/negative,S/N)>2.1。结论成功筛选鉴定了DV2型特异性抗原片段,初步建立了DV2 IgG抗体的ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性及灵敏性,为DF的鉴别诊断提供了技术手段。

肠出血型大肠埃希菌O104∶H4转运蛋白AatA单克隆抗体制备及鉴定

目的表达肠出血型大肠埃希菌O104∶H4的融合蛋白GST-Aat A,获得单克隆抗体。方法人工合成肠出血型大肠埃希菌O104∶H4的转运蛋白基因aat A,连接至p MDl8-T载体,转化E.coli DH5α,双酶切回收,构建原核表达质粒PGEX-6P-1-GST-Aat A,测序鉴定后,转化E.Coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot分析目的蛋白的表达并纯化该重组蛋白。将纯化后的融合蛋白GST-Aat A免疫Balb/c小鼠,制备相应单克隆抗体;并对该单克隆抗体的纯度、亚型、效价、特异性进行鉴定和分析。结果构建的原核表达载体PGEX-6P-1-GST-Aat A能表达融合蛋白GST-Aat A;亲和层析纯化后融合蛋白GST-Aat A纯度达到95%,免疫小鼠后得到相应特异性单克隆抗体。结论成功制备出一株抗转运蛋白Aat A的单克隆抗体,该抗体为Ig G1亚型,特异性好,效价高,纯度可达97%。

巢式-荧光定量PCR技术快速检测生殖支原体

目的建立生殖支原体巢式-荧光定量PCR快速检测技术。方法针对生殖支原体MgPa基因的保守片段(1414~1561bp),利用Primer express3.0设计引物及探针,巢式PCR扩增临床样本,纯化后克隆到载体,制备阳性标准品。优化PCR反应条件,研究其特异性、灵敏性和重现性。结果构建了含MgPa基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在101~109拷贝数之间有较好的线性关系。该方法检测阳性率高达15.4%,能特异性检测生殖支原体,而人型支原体、解脲脲原体、沙眼衣原体等检测为阴性;灵敏度高,可检测到10个拷贝数;3组重复试验的变异系数均小于3%。结论本研究建立了生殖支原体的快速检测技术,具有检测阳性率高、特异性强、灵敏度高、重现性好等特点。