人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达

将编码人组织激肽释放酶成熟蛋白的基因片段扩增并分别克隆到原核表达载体pET2 8(b)及分泌型表达载体pET2 0 (b)中 ,使其C端融合 6×HisTag序列 .转化不同受体菌 ,IPTG诱导表达后利用SDS PAGE、免疫印记等方法对重组蛋白进行分析 .在 6株基因工程菌株中 ,均表达出分子量约30kD的激肽释放酶融合蛋白 ,其中激肽释放酶在pET2 8载体中的表达水平高于pET2 0载体 .pET2 8和pET2 0载体表达的重组激肽释放酶蛋白分别占菌体总蛋白约 2 6 %和 10 % .Western印迹分析表明 ,目的蛋白可与抗人血清KK单克隆抗体发生特异性反应 .未经纯化的激肽释放酶融合蛋白具有一定的水解苯甲酰精胺酸乙酯 (BAEE)的能力 .在大肠杆菌中获得了人组织激肽释放酶的高效表达 ,表达产物具有免疫原性和生物活力 。

人组织激肽释放酶基因的克隆及测序分析

目的克隆中国人组织激肽释放酶基因 ,为开展基因治疗高血压研究奠定基础。方法提取人胰腺组织总RNA ,逆转录后进行PCR扩增。将PCR产物回收、插入质粒KS ,酶切鉴定后双向测序分析。结果本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比 ,有一个碱基不同 ,同源性为 99.8%。结论克隆的中国人组织激肽释放酶基因可用于基因治疗等深入研究工作。

HIV-1Gagp24蛋白的纯化及复性

为制备高纯度p24 抗原,在变性条件下,将大肠杆菌表达的重组p24 蛋白,使用Ni-NTA 亲和层析法进行了纯化。对包涵体中的p24 蛋白进行层析纯化时,回收率略有提高,但蛋白纯度(81% )低于菌体裂解纯化洗脱物(94% )。菌体中及纯化、复性后的目的蛋白均能与抗HIV-1 p24 单克隆抗体发生特异性反应。用纯化的p24 蛋白免疫小鼠,4 周时小鼠血清抗p24 平均抗体效价达1∶400。试验结果表明,大肠杆菌表达的HIV-1 p24 全菌体裂解物纯化后,可用作HIV-1 检测试剂的原料。

封闭ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响

目的:探讨通过封闭ERCC1基因表达干扰DNA损伤修复路径及其对卵巢癌细胞对铂类药物耐药性的影响。方法:构建ERCC1基因反义表达载体,转染人卵巢癌细胞A2780及A2780/CF70,采用Northern杂交及Western Blot分析人卵巢癌细胞内ERCC1基因RNA及蛋白表达水平变化;利用荧光素酶报告基因系统观察宿主细胞对DNA损伤的修复作用;采用MTT实验研究细胞对铂类药物耐药性的影响。结果:卵巢癌细胞转染反义ERCC1基因后,ERCC1基因转录水平、蛋白表达水平明显下降。荧光素酶报告基因系统结果证明,宿主细胞的DNA修复活性下降。MTT实验表明,伴随ERCC1基因表达水平下降,细胞对顺铂的耐药性降低。结论:转染ERCC1反义基因显著影响宿主细胞的核苷酸切除修复,影响细胞对顺铂的耐药性。

饲克山病病区粮大鼠血清和组织维生素E含量的改变

在克山病病因学研究中,目前人们普遍认为低硒(Se)是其发病的主要因素之一。最近,王凡等提出,维生素E(VE)和Se的共同缺乏是克山病发病的基本因素。但在克山病发病中。

HIV-1 Gag p^(17-)p^(24)在痘苗病毒中的表达及性质研究

研究了重组痘苗病毒表达的HIV1核心蛋白(Gag)p17p24蛋白的一些生物学及免疫学特点。间接免疫荧光、DotELISA及Westernblot结果表明,构建的两株重组病毒分别表达了HIV1Gagp24及p17p24融合蛋白。电镜观察证实,Gagp24及p1724重组蛋白均可形成病毒样粒子。重组病毒可诱导小鼠产生抗HIV1Gagp24抗体。重组病毒感染BHK21细胞后,可见由于细胞凋亡而致的染色体DNA断裂“梯子”电泳图。

氟斑牙儿童头发电子自旋共振特性研究

自由基和自由基反应广泛存在于机体的生命过程中,电子自旋共振(Electron Spin Pesonance,ESR)方法已成为医学研究机体中自由基的重要手段。

具有蛋白酶及解旋酶活性的HCV-NS3重组蛋白的纯化及活性分析

为深入探讨HCV-NS3蛋白的酶动力学性质,制备了具有蛋白酶及解旋酶活性的HCVNS3重组蛋白。利用PCR扩增HCV非结构基因NS3,插入pPIC9,测序分析。携带NS3基因的重组质粒(pPIC9-NS3)转化毕氏酵母菌菌株GS115,甲醇诱导表达NS3蛋白。重组蛋白首先采用Hitrapchelating柱进行亲和分离,之后使用MonoSHR柱进一步纯化。对纯化后的NS3重组蛋白的酶活性进行分析,结果表明,获得的重组蛋白分别具有蛋白酶及解旋酶活性。本研究为深入探讨NS3编码酶的功能和开发抗病毒药物创造条件。

人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒(Ad-hKLK1-IRES-EGFP),并观察在自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1,将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中,构建成重组穿梭质粒,将其与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染293A细胞,经包装并获得重组腺病毒,用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定,测定病毒滴度;用重组腺病毒感染VSMCs,用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率,用RT-PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确,并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP,其滴度为4.5×1011/L。重组腺病毒感染VSMCs后,在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达,感染率高达90%以上,可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达,并与感染时间(1 d-7 d)有显著依赖关系,峰值感染复数为100 MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP;感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达,该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。

硒和维生素E对饲予克山病病区粮大鼠肝脏自由基代谢的影响

饲予克山病病区粮对大鼠肝脏自由基代谢的影响及补充硒和维生素E的预防作用研究结果显示:病区粮组动物肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活性明显下降,脂质过氧化物含量和自由基水平显著升高。在病区粮饲料中分别加入100ppmDL-α-生育酚和0.22ppm亚硒酸钠,均可明显降低脂质过氧化物含量和自由基水平。病区粮组动物肝脏α-生育酚和还原型谷胱甘肽含量均明显增加,提示硒缺乏可增加其对维生素E的需要量和使还原型谷胱甘肽生成增多。结果表明,克山病病区粮食中的致病因素能引起动物肝脏自由基代谢的紊乱,硒和维生素E对其都有很好的预防作用,提示维生素E的相对不足也有可能在克山病发病机制中起重要作用。

EB病毒融合蛋白ZtaN-p23在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

目的:克隆EB病毒立即早期蛋白ZtaN和衣壳蛋白p23,构建原核表达载体,并在大肠杆菌中表达融合蛋白,为后续利用蛋白进行疾病诊断奠定基础。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从B95-8细胞中分别扩增出目的基因BZLF1N和BLRF2,利用融合PCR法将两个基因进行连接,构建重组质粒pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。加入IPTG诱导表达融合蛋白ZtaN-p23,通过SDS-PAGE和Western blot确定蛋白表达量及活性鉴定。结果:重组质粒pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2经双酶切鉴定和序列分析正确,证实已成功构建原核表达载体;SDS-PAGE显示诱导的蛋白Mr约46 000,与预期值一致;对融合蛋白表达条件进行优化后,发现其主要以包涵体的形式存在于细胞中;亲和层析结果显示纯化后的ZtaN-p23纯度>95%;Westernblot显示ZtaN-p23具有良好的生物活性。结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并在大肠杆菌中进行了表达纯化,融合蛋白显示出良好的活性。

导入人组织激肽释放酶基因治疗肾血管性高血压实验研究

目的构建重组人组织激肽释放酶基因真核表达载体并研究其骨骼肌注射对高血压大鼠的降压效应。方法以pBluescripeⅡKSKLK(+)为模板用PCR扩增人组织激肽释放酶基因,将其定向克隆至pcDNA3载体上,形成重组质粒pcDNA3/KLK,并经酶切和测序鉴定。给“两肾一夹”肾性高血压大鼠的股四头肌注入1000μgpcDNA3/KLK,,随后给予100V、1Hz、40ms电刺激6次,并用RT PCR、Western杂交检测人KLKcDNA在体内的表达。尾套法测血压每周2次。结果一次肌肉注射人组织激肽释放酶cDNA可明显延缓“两肾一夹”肾性高血压大鼠的血压升高;能降低血压达8～21mmHg。局部肌肉组织的信使核糖核酸(mRNA)和KLK表达阳性。结论成功构建了pcD NA3/KLK真核表达载体,肌肉注射人组织激肽释放酶基因可引起“两肾一夹”肾性高血压大鼠血压的持续性下降,显示了人KLK基因对高血压患者降压治疗的可能性。

克山病区玉米中维生素E和硒水平

克山病病区玉米中α-生育酚、γ-生育酚、硒含量分别为1.42±1.09μg/g、18.33±13.53μg/g 0.0100±0.0032μg/g,非病区分别为6.77±6.16μg/g、(?)25.99±12.50μg/g、0.0275±0.0131μg/g。其中α-生育酚、硒含量病区显著低于非病区,且α-生育酚和硒含量之间呈显著正相关。该结果提示,α-生育酚和硒的共同缺乏在克山病发病中起重要作用。

中国人TFPI-2基因的克隆及测序分析

目的对中国人的组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因进行克隆并测序。方法从人新鲜肝组织提取总RNA,经逆转录PCR(RT-PCR)扩增出TFPI-2的全长cDNA,经亚克隆、筛选、鉴定后,进行正反测序。结果中国人TFPI-2基因cDNA全长1222bp,除258bp、585bp和884bp处与目前GenBank中收录的国外学者克隆的TFPI-2基因序列不同外,其他完全一致。其序列Gen-Bank登记号TFPI AY691946。结论中国人TFPI-2基因序列与已经报道的西方人的TFPI-2基因序列基本相同,但三处单核苷酸多态性的意义何在,目前尚不清楚。

人组织激肽释放酶基因重组腺病毒转染对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨重组腺病毒介导的人组织激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCSHR)增殖和迁移的影响。方法:自行构建双顺反子重组腺病毒载体,携带强绿色荧光蛋白(EGFP)标志基因和目的基因hKLK1;用细胞计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞生长周期;蛋白免疫印迹法(Western blotting)测定细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1的表达。采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCSHR迁移。结果:(1)hKLK1基因转移呈感染复数依赖性(20-100MOI)抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR生长,100MOI时抑制率为39.3%;呈时间依赖性抑制VSMCSHR生长,第5d时达高峰,抑制率为35.2%。(2)hKLK1基因转移可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR增殖,峰值抑制率为30.2%(P<0.01);细胞周期阻滞于G0/G1期的VSMCSHR明显增多,最大阻滞率为36.4%(P<0.01),而缓激肽B2受体特异性阻断剂Hoe140逆转了hKLK的抑制作用。(3)hKLK1基因转移明显上调PDGF-BB诱导VSMCSHR的p27Kip1、p21Cip1表达,Hoe140明显降低p27Kip1、p21Cip1表达。(4)hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR细胞迁移,抑制率为34.6%,且Hoe140不影响该抑制作用。结论:hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR增殖,主要由缓激肽B2受体介导的,通过上调细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1表达的途径。而hKLK1基因转移抑制VSMCSHR迁移效应可能不通过B2受体。

人Ⅱ型免疫缺陷病毒gag基因在大肠杆菌中的表达

目的：表达ＨＩＶ２型基因工程ｇａｇ抗原。方法：将编码ＨＩＶ２型ｇａｇ的部分和全部ｐ５５ｇａｇ１／２基因，克隆到载体ｐＥＴ１７ｂ后，分别在Ｅ．ＣｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中表达。结果：表达产物为５１和６１ｋＤ融合蛋白，并可与ＨＩＶ２病人血清发生特异性反应。表达量分别为菌体总蛋白的１２．２％和６．２％。结论：上述两种ｇａｇ重组蛋白可在Ｅ．Ｃｏｌｉ中得到表达，且有良好的抗原性。

脂质过氧化作用对培养心肌细胞维生素E含量及膜流动性的影响

应用氢过氧化枯烯引发培养乳鼠的心肌细胞脂质过氧化损伤，观察维生素Ｅ含量及细胞膜流动性的变化。结果显示：脂质过氧化作用能引起心肌细胞维生素Ｅ含量明显下降，其中以ｒ一生育酚的消耗更为显著，细胞膜流动性也降低。提示维生素Ｅ在对抗心肌细胞脂质过氧化损伤上起重要作用。

月见草各部位必需元素含量测定

目的 :为了更好挖掘药源。方法 :采用 AAS、荧光法测定月见草和根下土壤中 1 0种人体必需宏、微量元素。结果 :所测元素含量各异 ,且因部位不同而异 ,并与土壤背景值有关 ;各元素加和量依茎、根、种子壳、种子、花、叶顺序增加 ,叶、花、种子是月见草植株中必需元素富含部位。结论 :提示月见草各部位中含有丰富的必需元素 。

HIV-2gag基因在重组痘苗病毒中的表达

以痘苗病毒ＨＡ基因为侧翼，将ＨＩＶ－２ｇａｇ基因部分序列（简称Ｇ１）和全部序列（简称Ｇ２）分别插入牛痘病毒Ａ型包涵体（ＡＴＩ）和串联１０个（与ＨＡ基因反向）或１６个（与ＨＡ基因同向）痘苗病毒Ｐ７．５组成的复合型启动子下游，构建了４个重组痘苗病毒表达载体质粒。经脂质体转染、鸡红细胞吸附试验筛选和免疫荧光鉴定，获得４株能稳定表达目的蛋白的重组痘苗病毒。实验结果表明，以ＨＡ基因为侧翼构建重组病毒的重组率约为０．１％，阳性重组率为２５％～１００％。实验中还发现，以ＨＡ基因为侧翼的重组痘苗病毒能够引起细胞融合，其可作为筛选重组痘苗病毒的另一种标志。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，表达的Ｇａｇ蛋白能被ＨＩＶ－２血清中的特异性抗体所识别，并能诱导小鼠产生抗ＨＩＶ－２Ｇａｇ抗体。

人免疫缺陷病毒I型 p24gag 基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。