CRISPR/Cas9介导下构建FN1敲除的DLD1细胞系及初步功能学研究

[目的]利用CRISPR/Cas9技术构建FN1基因敲除的人结直肠腺癌DLD1细胞系,并初步探讨FN1基因敲除对DLD1细胞增殖、迁移的影响。[方法]根据CRISPR/Cas9技术原理,设计针对FN1基因的crRNA,体外混合crRNA、tracrRNA、Cas9酶,形成核糖核蛋白(即RNP复合物)后转染至DLD1细胞,实现基因编辑。采用二维梯度稀释法挑取单克隆细胞系,使用测序及蛋白质印迹技术(Western Blotting)检测FN1基因敲除情况,通过CCK8、Transwell及划痕实验检测FN1敲除对DLD1细胞增殖、迁移的影响。[结果]测序结果表明,8号单克隆细胞系在靶点附近缺失1 366个碱基,造成FN1编码基因的移码突变,蛋白翻译提前终止。与未编辑细胞相比,DLD1FN1-KO细胞的增殖及迁移能力明显降低。[结论]成功构建DLD1FN1-KO细胞系。初步证实,与未编辑细胞相比,DLD1FN1-KO细胞在第5d增殖水平减慢约40%(P <0.001)、迁移水平减慢约27%(P <0.001)。