Lenti-TK介导间充质干细胞对鼻咽癌CD133^+干细胞的靶向迁移及杀伤作用

目的:观察慢病毒-胸苷激酶(lentivirus-thymidine kinase,Lenti-TK)/间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)对鼻咽癌CD133+干细胞的靶向迁移及杀伤作用。方法:构建包含TK基因的重组慢病毒表达载体Lenti-TK,感染MSC后得到Lenti-TK-MSC,RT-PCR及Western blotting检测Lenti-TK-MSC中HA-TK的表达。免疫磁珠法从鼻咽癌5-8F细胞中分选CD133+细胞;Transwell小室迁移实验检测Lenti-TK-MSC对CD133+5-8F细胞的趋向性;Lenti-TK-MSC联合更昔洛韦(ganciclovir,Lenti-TK-MSC/GCV)与CD133+5-8F细胞共培养,CCK-8试剂盒检测其对细胞的杀伤作用和旁观者效应。结果:成功构建重组慢病毒载体Lenti-TK,其滴度为1×108UT/ml,Lenti-TK(MOI=50)感染MSC 72 h时,感染效率达(95.1±0.1)%。Lenti-TK-MSC迁移至CD133+5-8F细胞组的细胞数明显多于CD133-5-8F细胞组、未分选5-8F细胞组[(83.0±8.7)vs(29.6±5.3)、(38.3±5.2),P=0.000]。Lenti-TK-MSC/GCV处理组与单独GCV处理组、Lenti-TK-MSC/GCV条件培养液(即Lenti-TK-MSC加入1 mg/L GCV培养48 h的培养上清)处理组相比,CD133+5-8F细胞的存活率明显降低[(37.2±2.3)%vs(98.5±3.1)%、(83.8±3.4)%,P=0.000]。Lenti-TK-MSC数量达到混合细胞总数(Lenti-TK-MSC和CD133+5-8F细胞)的20%时,CD133+5-8F细胞存活率为(68.2±2.3)%,表现出明显的旁观者杀伤效应。结论:Lenti-TK感染后MSC对鼻咽癌CD133+5-8F细胞具有靶向迁移及杀伤作用。

晚期鼻腔鼻窦腺样囊性癌21例临床特征分析

目的探讨发生于鼻腔鼻窦晚期腺样囊性癌的临床特征、治疗方法、预后及影响因素。方法分析2007年2月~2016年5月入住我院的21例晚期鼻腔鼻窦腺样囊性癌患者的临床资料,包括临床表现、临床分期、病理、治疗方法、局部复发、远处转移及预后等,并结合文献进行诊疗特征分析。采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行单因素生存分析,COX模型对影响预后的临床因素进行多因素分析。结果 21例患者中,实体型占比小于30%的有10例(47.6%),1、3、5年总生存率分别为100%、100%、71%,实体型占比大于等于30%的有11例(52.4%),1、3、5年总生存率分别为70%、40%、10%,两者差异有统计学意义(P=0.02),且实体型占比大于等于30%的患者预后较差。Log-rank检验及全变量模型下协变量的生存曲线表明病理分型对预后具有显著影响,T3期预后略优于T4期,源发于上颌窦略优于蝶窦,手术及放化疗综合治疗优于单纯手术及单纯放化疗。多因素Cox回归模型分析结果显示,病理分型、病程与预后关系密切(P=0.045、0.028)。结论鼻腔鼻窦腺样囊性癌发病率较低,症状表现无特异性,部分患者病程较长,多发鼻窦内,尤其是上颌窦,早期诊断较困难,等到就诊时多为晚期。晚期患者以手术结合术后放化疗的综合治疗方式为主。病理分型、病程、发病部位、分期、治疗方式、周围神经侵袭,手术切缘阳性,术后放疗剂量不足60 Gy可能是影响晚期腺样囊性癌患者预后的因素。

Nod1与Nod2模式识别受体在鼻息肉发病中的作用

目的探讨核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide binding oligomerization do main,NOD)模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)Nod1、Nod2在鼻息肉发病中的作用。方法分别采用免疫组织化学及Western-blot检测Nod1、Nod2蛋白在20例鼻息肉组织中的表达,同时以19例正常下鼻甲黏膜作对照;ELISA检测鼻息肉组织和下鼻甲黏膜组织中白细胞介素4(IL-4)的含量。结果 Western-blot结果提示:鼻息肉组织Nod1表达高于对照组,两组Nod2无明显差异。免疫组织化学示两种模式受体在两组中均有表达,主要表达于黏膜上皮细胞、腺体上皮、炎性细胞(如嗜酸性粒细胞)中,但Nod1在鼻息肉中表达强于对照组(P<0.05),Nod2在两组中的表达差异无统计学意义。ELISA检测示鼻息肉组织匀浆液IL-4高于正常下鼻甲黏膜组织,(P<0.05)。结论在鼻息肉组织中,Nod1表达增强,说明Nod1有可能参与鼻息肉的发病。

鼻内镜口腔途径选择性切除儿童肥大腺样体的手术技巧及疗效分析

目的探讨鼻内镜下经口腔电动吸切选择性切除儿童肥大腺样体手术方式及疗效分析。方法对有多种典型临床症状(包括打鼾、鼻塞、流脓涕、听力下降、口颌面部及生长发育畸形等)的56例腺样体肥大患儿,全麻下开口器撑开口腔并拉起软腭,经口腔插入70°鼻内镜显露鼻咽部肥大的腺样体,采用弯头正反向切割吸引刀头,明视下选择性吸切阻挡后鼻孔区的肥大腺样体部分,其余腺体组织保留,并与传统的盲刮法(79例)及鼻内镜下全切除法(25例)进行疗效比较。结果本组全部患儿术后l～3天打鼾症状基本消失,未见术后并发症。手术创伤轻,出血少,患儿恢复快,经随访1～6个月,鼻部阻塞症状消失及明显改善49例(占87.5%),13例有耳部症状者治愈及明显好转者9例(占69.2%)。而对照组盲刮法鼻症状改善有效率(62%),术后反应较重,出血较多;全切法有效率(84%),出血较多,术后反应较重。结论采用鼻内镜经口明视下选择性吸切阻挡后鼻孔区的肥大腺样体部分,具有手术在明视下操作,术腔较宽敞、安全有效、微创、出血少及术后恢复快等优点,在众多的手术方法中是一种较为理想的选择术式。

儿童重症监护病房78例体质量≤10 kg连续性肾脏替代治疗患儿的预后因素

目的探讨体质量≤10 kg危重症患儿连续性肾脏替代治疗的临床特点以及预后情况。方法回顾性分析2010年1月至2019年12月我院儿童重症医学科的体质量≤10 kg连续性肾脏替代治疗的患儿的临床资料,按临床结局分为存活组(n=38)和非存活组(n=40),分析患者的临床特点及预后因素。结果78例患儿纳入分析,存活组中局部枸橼酸抗凝的比例更高(92.1%vs.70%,P=0.029);CRRT启动时间在存活组的时间更短(以入住PICU到CRRT启动时计算),存活组的中位时间为18.6 h,非存活组的中位时间为66.5 h(P=0.002);CRRT启动时存活组的液体负荷更低(1.9%vs.8.6%,P=0.001)。多因素logistic回归分析结果显示,PRISMⅢ评分、液体负荷、CRRT启动时间>24 h是这一群体患儿预后的危险因素(OR=1.120、1.109、3.912,P<0.05)。结论体质量≤10 kg的患儿群体接受连续性肾脏替代治疗的存活率与液体负荷、PRISMⅢ评分和CRRT启动时间存在一定相关性。

鼻咽癌患者外周血端粒酶hTERT mRNA的定量检测及其临床意义

目的定量检测鼻咽癌患者外周血中端粒酶逆转录酶催化亚单位(h TERT)m RNA的表达,并探讨其在鼻咽癌中的诊断及治疗意义。方法采用实时荧光定量PCR技术(QPCR)检测33例鼻咽癌患者治疗(放疗或化疗)前后血浆中h TERT m RNA的表达,并分析其与临床病理因素的关联,以24例健康志愿者作为对照。结果结果显示,健康志愿者血浆中h TERT m RNA相对表达量为0.95±0.37,鼻咽癌患者血浆中h TERT m RNA含量达到10.75±4.29(P<0.05)。鼻咽癌患者血浆中h TERT m RNA的表达与年龄、性别无统计学差异(P>0.05),而与临床分期、T分期及N分期有显著性差异(P<0.05)。早期患者(Ⅰ、Ⅱ期),放疗后其表达量3.43±1.42较治疗前5.60±2.33明显下降;晚期患者(Ⅲ、Ⅳ期)诱导化疗及放疗后其表达量较治疗前12.68±3.08分别降为10.68±2.48、3.13±1.69(P<0.05)。结论鼻咽癌患者血浆中h TERT m RNA的表达明显升高,放化疗能够有效抑制该基因的表达,而且该基因的含量与肿瘤的临床分期、大小及淋巴结浸润范围等临床病理因素密切相关,从而提示检测鼻咽癌患者外周血中h TERT m RNA的含量,有可能为鼻咽癌患者早期诊断及疗效判断提供重要信息。

脂肪来源间充质干细胞调控变应性鼻炎小鼠T细胞免疫状态的研究

目的 探讨脂肪来源间充质干细胞（adipose—derivedstemceils，ADSC）对变应性鼻炎（allergicrhinitis，AR）小鼠辅助性T细胞（Th）、调节性T细胞（Treg）的调节作用及其机制。方法取Balb／c小鼠60只，采用随机数字表法随机分为6组（分组表示为：致敏／激发／处理），分别为实验组1（OVA／OVA／高剂量ADSC）、实验组2（OVA／OVA／低剂量ADSC）、实验组3（0VA／OVA／磷酸盐缓冲液PBS）、实验组4（OVA／OVA／0）、对照组1（PBS／PBS／0）和对照组2（O／O／0）。常规分离提取小鼠ADSC，卵清蛋白（ovalbumin，OVA）联合氢氧化铝构建AR小鼠模型，尾静脉注射CM-Dil标记的ADSC（高剂量组：3×10^6；低剂量组：1×10^6）连续3d，48h后处死，酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）检测血清中自细胞介素（interleukin，IL）4、IL-6、IL-10和叮干扰素（Y interferon，IFN-y）的水平，反转录聚合酶链反应（reversetranscriptasepolymerasechainreaction，RT—PCR）检测脾脏中上述各细胞因子mRNA的表达，荧光显微镜下观察ADSC在AR模型鼠鼻黏膜中的迁移分布，鼻黏膜HE染色观察嗜酸粒细胞浸润情况。以SPSS13．0软件进行统计学处理。结果成功分离培养并鉴定小鼠ADSC。AR模型小鼠症状学评分与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。实验组1与实验组4相比，血清IL4、IL-6水平下调[组1：（17．95±7．78）、（27．51±5．93）pg／ml；组4：（56．82±9．12）、（70．034-7．22）pg／m1]，IFN-1、IL-10水平上调[组1：（367．74±、13．79）、（417．10±72．40）p∥ml；组4：（199．464-11．25）、（122．50±15．57）pgZml]，差异均有统计学意义（P值均〈0．01）。实验组1与实验组2相比，血清IL-4、IL．6水平下调[组1：（17．95±7．78）、（27．51±5．93）pg／ml；组2：（41．57±12．27）、（56．21±9．23）pg／m1]，IFN-1、IL-10水平上调[组1：（367．74±13．79）、（417．10±72．40）pg／ml；组2：（281．77±30．41）、（203．454-87．10）pg／ml]，差异均有统计学意义（P值均〈0．01）。上述4种细胞因子mRNA水平与蛋白质水平呈现相同的变化特点。荧光显微镜下CM-Dil标记的ADSC可向鼻黏膜迁移分布，实验组1较实验组2有更明显的红色荧光。实验组1和实验组2较实验组4鼻黏膜中嗜酸粒细胞浸润明显减少。结论经静脉注入的ADSC可向AR模型小鼠鼻黏膜迁移，并发挥非特异性免疫调节效应。其机制可能是通过影响多种细胞因子的分泌进而调节Th1／Th2细胞免疫失衡和Treg细胞的功能而发挥作用，且在一定程度上与剂量相关。

变应性鼻炎患者主要鼻部症状与体内组胺及白三烯D4含量的相关性研究

目的:探讨变应性鼻炎(AR)患者主要鼻部症状与血清和鼻分泌物中组胺及白三烯D4(LTD4)含量的相关性,为AR的个体化治疗开辟新领域。方法:选取2014-01-2015-06期间收治的108例AR患者,按主要鼻部症状评分(喷嚏、流涕等)分成组胺症状组(喷嚏组)及白三烯症状组(鼻塞组),采用ELISA法测定AR患者血清和鼻分泌物中组胺和LTD4含量,分析症状与组胺及LTD4水平的相关性。结果:AR患者喷嚏积分为5.58±2.59,与血清和鼻分泌物中的组胺含量均呈正相关(r=0.79、0.78,均P<0.05),但与LTD4无明显相关性。鼻塞积分为5.34±2.36,与血清和鼻分泌物中的LTD4含量均呈正相关(r=0.74、0.72,均P<0.05),与组胺无明显相关性。血清中组胺及LTD4含量为(8.39±4.07)ng/ml和(0.356±0.155)ng/ml,分别与鼻分泌物中二者含量[(5.06±2.47)ng/ml及(0.215±0.092)ng/ml]呈正相关(r=0.99、0.98,均P<0.01)。结论:AR患者血清和鼻分泌物中的组胺水平升高与喷嚏组症状呈现高度一致性变化,血清和鼻分泌物中LTD4的含量升高与鼻塞组症状呈现高度一致性变化。

人鼻咽癌CD133＋干细胞对肿瘤多药耐药作用的研究

目的:探讨鼻咽癌CD133+干细胞中ABCG2表达情况及CD133+干细胞对肿瘤多药耐药的作用。方法:免疫磁珠分选、纯化鼻咽癌CD133+肿瘤干细胞,采用无血清培养、CCK-8法、平板克隆及裸鼠体内成瘤实验鉴定此肿瘤干细胞生物学特性;采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫组化检测分选前后的ABCG2/BCRP变化;采用CCK-8法比较分选前后鼻咽癌细胞的耐药情况。结果:成功分选并鉴定CD133+鼻咽癌干细胞;RT-PCR结果显示,耐药基因ABCG2在CD133+干细胞中表达灰度值为2.27±0.09,明显高于CD133-(0.69±0.01)和未分选细胞(1.00±0.00),F=886.99,P<0.01;CCK8结果显示,顺铂、紫杉醇和依托泊苷对CD133+鼻咽癌细胞的耐药明显增加,耐药指数分别为23.874、5.520和5.670,P均<0.01,而氯丙嗪的耐药指数为1.082,差异无统计学意义,P=0.488。结论:CD133+干细胞参与鼻咽癌多药耐药,靶向ABCG2联合氯丙嗪有可能成为克服肿瘤多药耐药新途径。

结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤临床特征分析

目的:探讨结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的临床诊疗特征及其影响因素,为临床个体化治疗提供依据和经验。方法:回顾性分析2009-12-2016-07期间收治的25例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者的临床资料,包括临床表现、血清EBV-DNA检测、影像学检查、Ann-Arbor分期、病理、治疗方法及预后等。所有患者均由病理确诊并进行标准、规范及系统的治疗。采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行单因素生存分析,Cox模型进行多因素分析并对影响预后的临床因素进行危险性评估。结果:25例患者中ⅠE+ⅡE期15例(60%),1年、3年总生存率(OS)分别为100%、100%;ⅢE+ⅣE期10例(40%),1年、3年OS分别为40.0%、26.7%,两者间OS差异有统计学意义(P=0.000)。采用单独放疗3例,1年、3年OS分别为100%、100%;单独化疗6例,1年、3年OS分别为53.6%、35.7%;放疗联合化疗综合治疗模式16例,1年、3年OS分别为84.6%、84.6%。3种治疗模式之间OS差异有统计学意义(P=0.027),且单独化疗者预后最差。进一步的多因素Cox回归模型结果显示,病程、B症状、EBV-DNA拷贝数阳性、治疗模式与该患者的预后转归关系密切(P=0.006、0.003、0.010、0.040)。结论:结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤侵袭性强,总体预后较差。Ann-Arbor分期、治疗模式、病程、B组症状、EBV-DNA拷贝数阳性与结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的预后有密切关系。对早期局限于鼻腔的患者可单独放疗,疗效较好;对侵袭范围较大或晚期患者宜首选放疗加化疗为主的联合治疗模式。

囊泡分子免疫病理学改变对鼻内镜术后鼻腔黏膜上皮预后转归的影响

目的:探讨囊泡分子免疫病理学改变对鼻内镜术后鼻腔黏膜上皮预后转归的影响。方法:依EPOS标准选取40例(80侧)慢性鼻窦炎、鼻息肉患者为研究对象,根据术后对囊泡处理方式的不同分为囊泡刮除(右侧)和不刮除(左侧);依据囊泡数量及大小分为轻度组(44侧,单侧术腔囊泡数目≤5个且囊泡直径均≤5mm)及中重度组(36侧,单侧术腔囊泡数目>5个或囊泡数目≤5个而囊泡直径>5mm)。鼻内镜下比较轻度组、中重度组术后鼻黏膜上皮化情况;用苏木精-伊红染色及透射电镜观察囊泡的病理形态学变化;免疫组织化学法比较术后不同时间各组(术后1～3周、6～8周及11～14周)和对照组(下鼻甲黏膜、鼻息肉)转化生长因子β1(TGFβ1)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化。结果:病理学观察发现,囊泡上皮基膜不连续、间质水肿、炎细胞浸润、病理性腺体增多;超微结构显示,囊泡微管结构出现异常,线粒体减少;分子免疫学结果显示,在术后1～3周、6～8周及鼻息肉组织中TGFβ1的表达明显高于术后11～14周及下鼻甲黏膜组织(P<0.05);术后6～8周及鼻息肉组织囊泡中VEGF的表达明显高于术后1～3周、11～14周及下鼻甲黏膜组织(P<0.05)。中重度组囊泡刮除较不刮除鼻黏膜更快上皮化,与轻度组比较平均时间缩短1.5周(P<0.05),轻度组囊泡刮除和不刮除对术腔黏膜上皮化的影响差异无统计学意义(P>0.05)。结论:囊泡是鼻内镜术后有可能经历的阶段,其出现可能提示是鼻腔黏膜术后对炎症存在的反映,存在病理形态学改变及VEGF、TGFβ1的高表达,VEGF、TGFβ1术后的动态变化可以成为鼻内镜术后鼻腔黏膜预后转归的监测指标之一。术后对中重度囊泡进行清除有利于鼻腔黏膜的恢复和愈合。

NLRs模式识别受体在变应性鼻炎患者发病中的作用和意义

目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域(NLRs)样模式识别受体家族Nod1、Nod2及Nalp3在变应性鼻炎(AR)患者发病中的作用和意义。方法:分别采用Real-Time RT-PCR、免疫组织化学及Western blot检测Nod1、Nod2、Nalp3蛋白在AR患者下鼻甲组织中的表达,以鼻中隔偏曲(NSD)患者下鼻甲黏膜作为对照,分别通过Western blot检测观察AR患者舌下脱敏治疗6个月后外周血单个核细胞中Nod1的改变,通过ELISA检测观察外周血IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ的变化。结果:3种Nods样受体在AR及NSD组鼻黏膜组织中均有表达,且主要表达于鼻黏膜上皮细胞、腺体上皮、炎性细胞(如浆细胞、嗜酸粒细胞)。但在AR组中Nod1mRNA及蛋白表达均低于NSD组(P<0.05),Nalp3mRNA及蛋白表达均高于NSD组(P<0.05);2组中Nod2mRNA、蛋白比较差异无统计学意义。脱敏治疗后6个月,Nod1表达改变与外周血IL-10的改变呈负相关(r=-0.88,P<0.05);Nod1表达改变与外周血IL-6的改变呈正相关(r=0.57,P>0.05)。结论:1Nod1、Nod2及Nalp3在2组组织中均有表达,但AR组Nod1表达低于NSD组,Nalp3高于NSD组,说明Nod1、Nalp3可能参与AR的发病。2舌下脱敏治疗6个月后,Nod1表达降低,其表达降低与外周血IL-10的改变呈负相关,提示Nod1可能通过调控IL-10变化参与舌下脱敏治疗机制。

PinX1基因对鼻咽癌细胞顺铂化疗敏感性的影响及其机制

目的 探讨PinX1基因对鼻咽癌细胞顺铂化疗敏感性的影响及其机制.方法 采用慢病毒构建的pCDH-CMV-PinX1-copGFP质粒载体转染鼻咽癌细胞,构建含PinX1基因载体的鼻咽癌Lenti-PinX1-5-8F细胞,同时构建Lenti-Ctrl-5-8F细胞（将不含PinX1基因的空载体转染5-8F细胞获得）及5-8F细胞作对照.将上述鼻咽癌细胞依实验分为4组：实验组为Lenti-PinX1-5-8F细胞＋顺铂组（含PinX1基因的Lenti-PinX1-5-8F细胞中加入顺铂药物）,对照组为Lenti-PinX1-5-8F细胞组（含PinX1基因）、顺铂药物组（5-8F细胞中加入顺铂）及5-8F细胞组.分别采用荧光定量PCR、流式细胞术、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、小室技术、Western印迹法及药物敏感试验检测PinX1基因表达、端粒酶活性、鼻咽癌增殖抑制、与顺铂抗癌的协同作用及肺耐药相关蛋白（LRP）及B细胞淋巴瘤基因-2（Bcl-2）基因的表达,观察PinX1基因在鼻咽癌细胞中对顺铂化疗敏感性的影响及其机制.结果 Lenti-PinX1-5-8F细胞中端粒酶活性相对量均显著低于Lenti-Ctrl-5-8F细胞、5-8F细胞（0.146±0.004比0.967 ±0.016、1.000±0.034,均P＜0.01）.16 μg/ml的顺铂与PinX1基因联合能显著增强端粒酶活性下调后对鼻咽癌细胞的抑制作用.Lenti-PinX1-5-8F细胞＋顺铂组的细胞增殖指数均显著低于Lenti-PinX1-5-8F细胞组、顺铂药物组、5-8F细胞组[（14.39±3.66）％比（32.97±3.00）％、（31.18±4.24）％、（47.19±4.19）％,均P＜0.01].Lenti-PinX1-5-8F细胞中LRP、Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.64±0.14、0.57 ±0.12,均显著低于Lenti-Ctrl-5-8F细胞的0.84±0.19、0.81±0.16和5-8F细胞的0.83±0.35、0.78±0.27（均P＜0.01）.结论 PinX1基因能增强顺铂对鼻咽癌细胞的化疗敏感性,其作用有可能是通过下调鼻咽癌细胞端粒酶活性、抑制Bcl-2和LRP基因而实现的.

Nods样模式识别受体在鼻息肉组织中的表达及意义

目的:探讨Nods(核苷酸结合寡聚化结构域,Nod Like receptors)样模式识别受体(PRR)在鼻息肉组织中的表达及作用。方法:分别采用实时定量RT-PCR、Western-Blot及免疫组织化学检测Nod1、Nod2、Nalp3mRNA及蛋白在鼻息肉组织中的表达(以正常下鼻甲黏膜作对照)。结果:实时定量RT-PCR显示,鼻息肉组织Nod1、Nod2、Nalp3mRNA表达与正常对照下鼻甲黏膜比较无显著差异。Western-Blot结果提示:鼻息肉组织Nod1表达高于对照组,两组Nod2、Nalp3无明显差异。免疫组织化学表明,三种模式受体在两组中均有表达,主要表达于上皮细胞、腺体上皮、炎性细胞(如嗜酸粒细胞),但Nod1及Nalp3在鼻息肉中表达强于对照组(P<0.05),Nod2蛋白表达无显著差异。结论:在鼻息肉组织中,Nod1、Nod2及Nalp3均有表达,其中Nod1、Nalp3的表达高于对照组,说明Nod1、Nalp3有可能参与鼻息肉的发病。

缺氧调控端粒酶活性及抑制鼻咽癌细胞增殖实验研究

目的探讨缺氧及siRNA沉默缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）后对鼻咽癌细胞中端粒酶催化亚单位（telomerase catalytic subunit,hTERT）、细胞周期和化疗耐药的影响。方法采用三气培养箱对鼻咽癌细胞5-8F和CNE2进行缺氧处理（1%O2）,蛋白质印迹法检测不同乏氧时相（0~72h）HIF-1α和hTERT蛋白的表达。将HIF-1α基因特异性siRNA分别转染鼻咽癌细胞株5-8F和CNE2,筛选出沉默效率最高的siRNA,实验分为未处理组（常氧）、未处理组（缺氧）、Negative-siRNA（缺氧）和HIF-1α-siRNA（缺氧）,荧光定量PCR及蛋白质印迹检测瞬时转染后hTERT及HIF-1α的表达。流式细胞术（flow cytometry,FCM）分析缺氧或沉默HIF-1α后对细胞周期的影响。MTT法检测缺氧或沉默HIF-1α后,鼻咽癌细胞对顺铂（DDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）的化疗敏感性。结果缺氧处理0~72h后鼻咽癌5-8F细胞HIF-1α（F=37.147,P〈0.001）和hTERT（F=70.069,P〈0.001）蛋白的表达上调,差异有统计学意义。HIF-1α-siRNA对5-8F细胞瞬时转染率〉98%。HIF-1α-siRNA组hTERT mRNA表达量为0.37±0.05,显著低于未处理组（缺氧）的1.00±0.00和Negative-siRNA（缺氧）的0.95±0.01,F=360.339,P〈0.001;hTERT蛋白表达量为（0.27±0.05）,显著低于未处理组（缺氧）0.54±0.00和Negative-siRNA组（缺氧）0.53±0.01,F=24.010,P〈0.001。未处理组（缺氧）G0/G1期细胞比例明显增加（45.63±2.01）%,显著高于未处理组（常氧）的（26.75±1.28）%,P〈0.001。5-8F细胞未处理组（常氧）对5-FU的IC50分别为（17.30±3.31）μg/mL,未处理组（缺氧）为（32.04±12.75）μg/mL,Negative-siRNA组为（33.90±0.87）μg/mL,HIF-1α-siRNA组为（13.72±2.36）μg/mL,F=3.704,P〈0.001。5-8F细胞缺氧组对DDP的化疗敏感性也降低,沉默HIF-1α后,5-8F细胞对DDP的化疗敏感性明显提高。除细胞周期外,CNE2与5-8F的结果均一致。结论缺氧促使鼻咽癌细胞发生G1/S阻滞及化疗耐药,可能与上调hTERT表达,进而上调端粒酶活性有关;沉默HIF-1α显著逆转缺氧诱导的肿瘤耐药并下调端粒酶活性。

外周血循环hTERT mRNA和CK19 mRNA的表达与鼻咽癌肿瘤微转移的相关性研究

目的探讨鼻咽癌患者外周循环血人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA和细胞角蛋白19(CK19)mRNA表达与肿瘤微转移的相关性。方法采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)定量检测44例鼻咽癌患者治疗前后外周循环血hTERT mRNA及CK19mRNA定量表达,并分析其与临床病理特征的关系,同时以20例健康体检者作为对照。结果对照组外周血中CK19mRNA相对表达量为0.85±0.50,鼻咽癌患者外周血中CK19mRNA水平为10.97±4.60,差异有统计学意义(t=-14.39,P<0.01);健康体检者外周血中hTERT mRNA相对表达量为1.09±0.40,鼻咽癌患者外周血中hTERT mRNA水平为10.45±3.81,差异有统计学意义(t=-16.64,P<0.01)。鼻咽癌患者外周血hTERT mRNA和CK19mRNA的表达与临床分期、T分期、N分期、M分期有相关性(P<0.05)。治疗后鼻咽癌患者hTERT mRNA的表达量由10.75±3.81降低至5.46±2.00,而CK19mRNA的表达量(5.63±1.91)较治疗前(10.97±4.60)亦明显下降(P<0.01)。结论鼻咽癌外周血hTERT mRNA和CK19mRNA的表达有可能作为预测外周血肿瘤细胞微转移和判断疗效的指标之一。