硫对酵母生物富铬过程中铬胁迫的缓解作用

【目的】探讨酿酒酵母YSI-3.7在富集Cr(Ⅲ)形成葡萄糖耐量因子(GTF)过程中自身抗氧化机制以及硫在该过程中发挥的作用,以期揭示硫对降低铬胁迫,进而提高生物富铬的作用机理。【方法】以高产GTF酿酒酵母YSI-3.7为目的菌株,通过设置不同浓度的Cr(Ⅲ)、硫组合进行生物富铬,测定不同条件下YSI-3.7菌株的生物富铬量以及相应氧化应激指标(如丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等)的变化,分析硫对酵母菌体在Cr(Ⅲ)胁迫下的改善作用。【结果】低浓度Cr(Ⅲ)(200μg·mL^(-1))会刺激酵母YSI-3.7生长,使其生物量增加;而高浓度Cr(Ⅲ)(>500μg·mL^(-1))对酵母生长有抑制作用。Cr(Ⅲ)浓度为500μg·mL^(-1)时,酵母中有机铬含量为(725.55±55.08)μg·g^(-1) DCW,总铬含量达(1 255.53±43.75)μg·g^(-1) DCW;Cr(Ⅲ)浓度为800μg·mL^(-1)时,有机铬为(536.25±36.89)μg·g^(-1) DCW,其中,总铬含量达(1 812.22±38.24)μg·g^(-1) DCW。随Cr(Ⅲ)浓度的增加(0—800μg·mL^(-1)),菌体中MDA含量从11.83 nmol·mL^(-1)升高到18.04 nmol·mL^(-1)。SOD和CAT活力随Cr(Ⅲ)浓度升高而降低。在较低Cr(Ⅲ)浓度(≤500μg·mL^(-1))下,谷胱甘肽(GSH)、总巯基、总抗氧化能力(T-AOC)含量均升高,但在高浓度Cr(Ⅲ)(800μg·mL^(-1))下会降低。1 mmol·L^(-1) Na_2SO_3可以缓解Cr(Ⅲ)的胁迫作用,此时,酵母中蛋白质含量上升,MDA含量降低12.83%,CAT活力基本无影响,SOD活力提高4.41%,GSH、T-AOC、GSH-Px含量分别增加28.83%、14.29%和18.80%。【结论】酵母富铬过程中,Cr(Ⅲ)胁迫作用可造成酵母膜脂过氧化程度加重。在较低铬浓度时(≤500μg·mL^(-1)),酵母可以通过自身抗氧化酶系统缓解该胁迫作用,其中发挥重要作用的是谷胱甘肽及其相关酶。高浓度Cr(Ⅲ)(800μg·mL^(-1))下,膜脂过氧化程度进一步加重,酵母自身抗氧化能力不足以抵御Cr(Ⅲ)胁迫。硫(1 mmol·L^(-1) Na_2SO_3)可以通过提高酵母中SOD活力、GSH、T-AOC、GSH-Px含量,减轻Cr(Ⅲ)造成的膜脂过氧化程度,提高酵母自身抗氧化能力,进而提高酵母生物富铬效率。

生物富铬与人体营养健康

铬是人体的基本营养元素之一,主要通过激活体内铬调素来协同或增强胰岛素功能,从而调节糖类、脂类等正常代谢。食物的精细加工、应激状态以及衰老都会导致人体的铬流失。缺铬已成为诱发糖尿病的主要原因之一。膳食补铬是预防和控制糖尿病及其并发症重要途径。酵母源葡萄糖耐量因子(GTF)可有效调节糖代谢、提高胰岛素与受体的亲和力、改善脂肪代谢,具有安全性高、吸收率高等特点,是重要的补铬制剂和辅助降糖保健因子。综述了铬在糖尿病改善的研究、铬补充剂研发现状以及铬摄入的法规。

GTF高产酵母菌体中铬元素的分布规律

应用先进材料学分析的手段并结合生物电镜技术,对酵母生物富铬过程中细胞的变化以及铬在细胞中分布进行探究,揭示酵母富铬机理。以不同剂量的铬处理酵母细胞,利用扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察酵母细胞吸附Cr3+形成GTF过程中细胞形态变化;利用能谱分析仪-透射电子显微镜(EDS-TEM)、飞行时间二次离子质谱仪(TOF-SIMS)分析铬在酵母细胞中的分布;采用EDTA洗脱法和原生质体制备法对酵母细胞进行组分分离,用火焰原子吸收法测定其各部位的铬含量,印证能谱及质谱的测定结果。结果表明:随着培养基中Cr^3+质量浓度的升高,酵母细胞形状由规则的椭圆形变成长轴拉长的椭圆形;并且在Cr^3+质量浓度为500,800μg/mL时,表面出现沉淀,内部出现空泡。当Cr^3+质量浓度为500μg/mL时,酵母细胞吸附的总铬和有机铬含量均最高,分别达到1 803.87μg/g·DCW(Dry Cell Weight)和1 133.91μg/g·DCW。其中吸附的总铬有14.43%集中在细胞壁,另外85.57%集中在原生质体,且原生质体吸附的铬中有73.29%以有机铬的形式存在,结合原生质体与细胞壁的质量比约为5∶1,可得铬在YSI-3.7细胞壁和原生质体空间分布均匀。EDS-TEM和TOF-SIMS的结果,进一步验证了这个结论。

具有α-葡萄糖苷酶抑制作用益生菌的筛选及特性分析

以实验室77株益生菌为研究对象,从其菌体细胞代谢物(cell-free excretory supernatants,CFS)和细胞内容物(cell-free extracts,CFE)两方面分析菌株对α-葡萄糖苷酶的抑制活性;同时还从耐酸性、细胞黏附性等方面对具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株进行了益生特性评价;最后利用主成分分析进行综合性评价,以期筛选出具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的益生菌。结果表明,77株益生菌的CFE对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用;而CFS对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用,抑制率为2.53%~15.76%。选取抑制率明显高于其他益生菌(编号为ST-2、1.1881、GS-3和BLP12)菌株进行益生特性的研究。其中ST-2表现出很高的耐酸性和细胞黏附性;GS-3在模拟消化液中有很强的耐受性等,各菌株特性不一。主成分分析表明菌株BLP12的综合性能最好:其对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达15.10%;于pH 2.0孵育3 h后,存活率能达到71.04%;于2.0%的胆盐条件下孵育24 h,存活率为0.70%;依次经模拟唾液、胃液、肠液消化后,存活率仍能达到88.27%,但对HT-29细胞的黏附率较低,仅为1.93%,总体上菌株BLP12对体外模拟胃肠环境的适应性很强。该菌株经过16S基因序列鉴定为植物乳杆菌,可作为降糖益生菌株应用于降糖食品的开发。

酵母源葡萄糖耐量因子GTF的纯化及其铬价态分析

酵母源葡萄糖耐量因子(glucose tolerance factor,GTF)可有效调节糖代谢、提高胰岛素与受体的亲和力、改善脂肪代谢。但GTF中的铬的价态不清严重限制了它在辅助降糖保健食品的中应用。实验优化了氨水联合有机溶剂提取GTF的方法。通过两级分子筛联用对GTF进行纯化,得到纯度较高的GTF。采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)联用电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)技术对GTF中铬价态进行分析鉴定。结果表明,富铬酵母粉经0.1 mol/L氨水振荡提取4 h后,上清液再经30%乙醇静置20 min,离心收集上清液。该粗提液中铬含量为133μg,铬蛋白比为5.015;相比与氨水提取法(铬蛋白比0.804),氨水联合有机溶剂法的铬蛋白比提高了6倍,提取效率提高极大。GTF粗提液再经两级葡聚糖凝胶层析柱分离纯化,得到了一个与铬峰重合的蛋白峰。利用HPLC-ICP-MS对其进行铬价态分析,图谱显示GTF样品中铬出峰的时间为31~90 s,出峰时间与Cr(Ⅲ)的出峰时间一致,有且只有一个铬峰,GTF中的铬是以Cr(Ⅲ)形态存在,无Cr(Ⅵ)存在。该结果为GTF保健食品或安全膳食铬补充剂的开发提供了理论依据。

以猪小肠黏膜提取物作为α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶Ⅳ的酶活力分析体系的建立

α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase 4,DPP-4)是II型糖尿病治疗中2种重要的靶向酶。这两种商品化酶价格昂贵且主要来源于微生物,难以有效用于两种酶抑制剂的筛选,而这两种酶均普遍存在哺乳动物的小肠中。为了获得经济有效、来源于哺乳动物体内的α-葡萄糖苷酶和DPP-4,本研究收集新鲜的猪小肠黏膜分泌物及上皮细胞,对比分析了猪小肠不同部位黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶和DPP-4的活力。以猪小肠黏膜提取物作为α-葡萄糖苷酶和DPP-4的酶反应体系,并且利用这两种酶的阳性药(阿卡波糖和抑二肽素A(diprotin A,IPI))分别进行了抑制率验证和评价。阿卡波糖对商品和猪回肠源α-葡萄糖苷酶的半数有效抑制质量浓度(median inhibition concentration,IC50)分别是1.1024、0.2447 mg/mL;IPI对商品和猪回肠源DPP-4的IC50分别为19.1197、41.2684μg/mL。通过比较发现,猪回肠黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶和DPP-4比活力分别为0.0841、0.0534 U/mg,在3种黏膜提取物中均为最高,因此选择猪回肠黏膜提取物作为商品化α-葡萄糖苷酶和DPP-4的替代物进行抑制剂的筛选。

扫描电子显微镜和原子力显微镜对于酵母表面形貌观察的比较分析

扫描电子显微镜和原子力显微镜均被广泛应用于样品表面形貌的检测分析。本文以正常酵母和富铬损伤后的酵母为研究对象,利用扫描电镜和原子力显微镜分别对正常和破损的细菌整体群落和单个菌株的形貌变化进行比较观察。通过观察结果,分析扫描电镜和原子力显微镜在表面形貌观测上各自具有的特点及优势。将两种观测技术优势性能结合互补,可以得到更加全面、准确的样品表面形貌特性,为两个大型仪器的联合分析提供了理论基础。