IL-18调控血管平滑肌细胞TNF-α、IL-6、IL-8的表达

目的初步探讨白细胞介素(IL)-18调控血管平滑肌细胞(VSMC)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-8表达及其机制。方法以不同浓度的IL-18(3、10、30、100ng/ml)处理VSMC,采取不同时间,通过Real-timePCR分析TNF-α、IL-6、IL-8mRNA水平的表达;ELISA方法分析TNF-α、IL-6、IL-8蛋白水平表达;用特异性抑制剂分别阻断p38和AKT信号通路,通过Westernblot分析这2条信号途径激活情况及对TNF-α、IL-6、IL-8蛋白表达的影响。结果不同浓度的IL-18能促使VSMC中TNF-α、IL-6、IL-8mRNA水平表达升高,表现出剂量依赖效应;IL-18(30ng/ml)以时间依赖的方式增加3种细胞因子的mRNA及蛋白水平表达。Western blot结果显示IL-18能够激活p38和AKT;特异性阻断剂分析显示:IL-18调控TNF-α、IL-6、IL-8的表达部分依赖该2条信号途径的激活。结论IL-18部分依赖p38和AKT信号通路的活化从而促使VSMC中TNF-α、IL-6、IL-83种炎症因子表达增高。

LSS基因敲除小鼠的饲养、繁殖及基因型鉴定

探讨羊毛固醇合成酶(LSS)基因敲除鼠的繁育和基因型分析。将引进杂合子小鼠进行饲养并繁育,提取其基因组DNA,利用PCR反应扩增目的基因片段,鉴定出小鼠的基因型;Western blot分析并比较LSS基因敲除杂合子小鼠和野生型小鼠的肝脏、皮肤组织中LSS蛋白的表达情况。成功的繁育出LSS基因敲除小鼠,使用PCR鉴定其子代小鼠包括野生型(LSS^(+/+),Wt)、杂合子(LSS^(+/-)),未出现纯合敲除小鼠;Western blot结果表明:相较于野生型小鼠,LSS基因敲除杂合子小鼠在肝组织和皮肤组织中表达LSS蛋白量少;杂合子敲除鼠的生存能力比野生型小鼠弱。获得LSS基因敲除小鼠,PCR鉴定小鼠基因型具有简单、稳定的优点。

LSS基因功能缺失对雄性小鼠生殖的影响

目的研究羊毛固醇合成酶(LSS)基因功能缺失对小鼠生殖的影响。方法取8周龄的LSS^(+/+)(WT)型和LSS^(+/-)(KO)型鼠雌雄共30只鼠,分别按♂WT×♀WT、♂WT×♀KO、♂KO×♀WT、♂KO×♀KO分组进行1:1合笼,时长4个月,统计每胎生仔个数及平均产仔周期;取WT型和KO型小鼠的血清,进行性激素检测;用TUNEL染色观察睾丸中生精细胞的凋亡情况;用Western blot检测睾丸组织中Tubulin、LSS和凋亡相关蛋白(GPX4/Bax/Bcl-2)的表达。结果配繁结果显示♂WT×♀WT与♂KO×♀KO相比,每胎平均生仔个数差异有统计学意义,其余组别均无差异,产仔周期4组的差异均无统计学意义;WT型和KO型小鼠性激素检测结果相比,差异也无统计学意义;TUNEL染色结果可以观察到,基因敲除鼠的睾丸组织中生精细胞凋亡增多;Western blot结果中,与WT型相比,KO型小鼠的凋亡相关蛋白(GPX4/Bax/Bcl-2)表达量均无差异。结论LSS基因功能缺失会导致小鼠生精细胞凋亡增加,其可能影响小鼠的生育能力。

胺丁羟磷酸盐抑制皮肤角质形成细胞的增殖作用

目的 探讨胺丁羟磷酸盐(ALD)对皮肤角质形成细胞(KCs)增殖的影响及中间产物是否拮抗其影响。方法 一定浓度的ALD、甲羟戊酸(MVA)、胆固醇(CH)、法尼基焦磷酸(FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)单独或联合处理KCs,细胞活力测定实验(MTS)法分析各处理组对KCs细胞增殖的影响;利用流式细胞术检测各加药组对细胞周期的影响;Western blot分析各加药组对细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、Cyclin E和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂(P21)及磷酸化的蛋白激酶B(pAKT)和磷酸化的胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)表达量的影响。结果 MTS实验表明ALD对KCs增殖有显著抑制作用,而上游产物MVA与其有协同效应;下游产物中仅CH有部分补救作用。流式细胞术检测结果显示KCs被ALD阻滞在细胞分裂间期G1期,而仅CH可减弱ALD导致的G1期阻滞。Western blot结果表明ALD显著下调Cyclin B1,同时上调Cyclin E和P21的表达。此外,ALD能促进磷脂酰基酶3-激酶-蛋白激酶B(P13K-AKT)信号通路,抑制丝裂原激活蛋白激酶-胞外信号调节激酶(MAPKS-ERK1/2)信号通路的激活。结论 ALD显著抑制原代KCs的增殖,CH对这种抑制有部分的补救作用。

基于转录组测序筛选不同性别C57BL/6J小鼠差异基因及通路

目的通过转录组测序筛选雌性与雄性C57BL/6J小鼠差异基因及通路,为进一步探讨小鼠雌雄间行为学差异的分子机制奠定基础。方法C57BL/6J品系的8周龄雌性与雄性小鼠,完整分离小鼠海马体组织,提取总RNA后逆转录构建cDNA文库,并在华大基因平台上生成单端为50个碱基的读数进行转录组测序。测序结束后基于GO和KEGG数据库,结合R语言中的phyper函数对数据进行筛选、校正和富集分析,计算P值;然后对P值进行矫正得到Q值并基于超几何测试方法对带注释的不同基因表达情况进行了分析,筛选出不同性别小鼠海马体中的差异基因及通路。测序结束后,使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证在雌雄小鼠海马中筛选出的差异基因并比较差异基因在不同信号通路上的表达情况。结果通过雌雄差异比较,筛选出325个差异基因,其中上调基因233个,下调基因92个,这些差异基因功能主要富集于长时程增强(LTP)、钙离子信号通路、尼古丁成瘾等过程;雌雄差异基因相互作用网络共有362个连接点和1703个相互作用边,筛选出的10个核心基因分别为:赖氨酸脱甲基酶5D(Kdm5d)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdkl5)、细胞输出介质(Cle1)、多巴胺受体6a3(Slc6a3)、盒式转录因子(Fox)、前体mRNA加工因子4B(Prpf4b)、甘氨酸受体4(Glur4)、钙离子受体2(Camk2)、DNA和RNA结合蛋白家族(Son)、5-羟色胺受体5b(Htr5b)。RT-qPCR验证结果与测序结果一致。结论从雌雄小鼠海马体中筛选出差异基因为研究不同性别小鼠行为学差异提供实验思路并为后续小鼠行为学研究做出针对性实验设计。

法尼基转移酶抑制剂和香叶基香叶基转移酶抑制剂对皮肤角质形成细胞增殖的抑制作用

目的探讨法尼基转移酶抑制剂(FTI)和香叶基香叶基转移酶抑制剂(GGTI)对皮肤角质形成细胞(KCs)增殖的影响。方法使用不同浓度的FTI、GGTI对KCs进行处理,细胞活力测定实验(MTS)法分析KCs增殖受各处理组的影响;利用流式细胞术检测各加药组细胞周期受一定浓度FTI、GGTI的影响;Western blot分析各加药组细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinE和P21及pAKT和pERK1/2表达量受一定浓度FTI、GGTI的影响。结果MTS显示FTI、GGTI对KCs增殖有抑制作用,并呈浓度依赖性,FTI(5μmol/L)、GGTI(5μmol/L)时KCs细胞活力最小,抑制率分别为14.7%、24.5%。流式周期结果表示FTI、GGTI阻滞KCs在G1、G2、S各期不明显。Western blot结果表明FTI、GGTI均能够下调CyclinB1,并且可以上调P21和CyclinE的表达。同时,FTI、GGTI能促进P13K-AKT信号通路的激活,抑制MAPKS-ERK1/2信号通路的激活。结论FTI、GGTI对原代KCs的增殖有抑制作用。

羊毛固醇合成酶抑制剂RO对KCs细胞增殖的影响

目的研究羊毛固醇合成酶抑制剂(RO)单独或联合胆固醇(CH)使用对皮肤角质形成细胞(KCs)细胞增殖及细胞周期的影响。方法 RO不同剂量作用KCs一定时间,采用MTS比色法检测KCs细胞增殖的变化;使用一定浓度的RO单独或联合CH作用KCs不同时间,使用MTS比色法和流式细胞仪检测记录KCs细胞增殖和细胞周期的变化;单独使用相同浓度RO或联合CH经过不同时间刺激KCs后通过蛋白质免疫印迹法对细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinE表达水平进行分析。结果 RO抑制KCs细胞增殖,并呈浓度和时间依赖性;联合使用CH降低RO对KCs的增殖抑制作用;RO可时间依赖性增加KCs细胞周期在G1期比例,联合使用CH缓慢增加KCs周期在G1期比例;RO可时间依赖性降低细胞周期调控蛋白CyclinB1、CyclinE的表达,联合使用CH部分拮抗RO下调CyclinE,并具有时间效应,而CyclinB1的表达没有受到明显的影响。结论 RO可能通过影响CyclinB1、CyclinE的表达使KCs细胞周期G1期阻滞进而抑制KCs增殖。

羊毛固醇合成酶抑制剂对KCs细胞分化和凋亡的影响

目的探究单独应用羊毛固醇合成酶抑制剂(RO)或联合胆固醇(CH)刺激皮肤角质形成细胞(KCs)后对其分化及凋亡的影响。方法RO单独或联合CH于KCs共培养不同时间后,加入Ca^(2+)(1.8 mmol/L)处理1d,Western blot法分析KCs的分化相关蛋白角皮蛋白(INV)和兜甲蛋白的表达;RO单独或联合CH与KCs共培养不同时间后,流式细胞术检测KCs细胞凋亡变化和Western blot法验证凋亡蛋白Bax和Bcl-2表达。结果RO下调KCs,Ca^(2+)诱导的分化标志蛋白INV的表达,对Loricrin表达抑制作用较弱,而CH没有表现出对RO的拮抗效应;RO诱导KCs细胞凋亡并呈时间依赖性,CH能够拮抗RO对KCs的诱导凋亡作用;RO单独应用时细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达均受到抑制,联合CH应用能部分拮抗RO对Bcl-2表达抑制作用,对Bax的表达抑制无显著影响;RO能时间依赖性降低Bcl-2/Bax的比值,CH能部分减弱RO对Bcl-2/Bax比值的影响。结论RO可能通过下调Loricrin、Bcl-2的表达,进而抑制KCs分化和诱导KCs细胞凋亡。