不同存储温度的huMSC-exo对UVB辐照HaCaT细胞的修复作用研究

目的探究了不同存储温度的huMSC-exo对UVB辐照HaCaT细胞的修复作用,为外泌体存储选择适宜的温度条件提供理论依据。方法采用超速离心法从huMSC培养基上清中提取外泌体,用Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术和透射电镜技术进行表征,并置于–80、–20、4、25和45℃存储1、3、7、14、30、50、100和150 d。构建UVB辐照HaCaT光老化细胞模型,用huMSC-exo处理24 h后观察细胞形态、检测细胞存活率、SA-β-gal活性、T-SOD活性、MDA和LDH含量。结果huMSC-exo呈具有清晰膜的茶托样结构,尺寸中位数为114 nm,30~150 nm囊泡数量占比约61.42%,表达外泌体表面标记蛋白CD9、CD63和CD81。–80℃和25℃存储1~150 d的huMSC-exo能显著提高UVB辐照HaCaT细胞存活率、恢复细胞形态、降低SA-β-gal活性、部分恢复细胞T-SOD、MDA和LDH水平;–20℃存储的huMSC-exo对HaCaT的增殖活性、细胞形态和SA-β-gal活性有恢复作用;4℃存储的huMSC-exo能减轻细胞老化水平;45℃存储的huMSC-exo无显著修复作用。结论–80℃、25℃存储的huMSC-exo能够显著恢复UVB辐照引起的HaCaT损伤,–20℃、4℃huMSC-exo作用效果次之,45℃的huMSC-exo无显著影响,提示–80℃和25℃能够较好地维持huMSC-exo的生物学功能。

人脐带间充质干细胞对HaCaT细胞增殖与迁移的影响

目的探讨人脐带间充质干细胞(hucMSCs)对人表皮角质形成细胞增殖与迁移的影响及其可能机制。方法采用Ⅱ型胶原酶消化法从新生儿脐带中分离制备hucMSCs,用流式细胞术鉴定P3代hucMSCs表面标记抗原,用油红O染色、茜素红S染色和Masson染色进行间充质干细胞三向分化能力鉴定;以人表皮角质细胞系HaCaT为研究模型,在transwell上室接种P3代hucMSCs进行共培养,显微镜观察24、48和72 h时HaCaT的细胞形态,CCK8法检测细胞增殖状况,划痕法检测细胞12 h和24 h迁移率,qRT-PCR法测定HaCaT细胞迁移、增殖相关生长因子KGF-2、FGFR-2、TGF-β1,以及细胞外基质蛋白Fibronectin、MMP-1和CollagenⅠmRNA表达水平。结果hucMSCs呈成纤维细胞样贴壁生长,其表面间充质干细胞标志性抗原CD105、CD90、CD73阳性表达率分别为98.35%、99.97%和99.94%,不表达CD45、CD34、CD14和CD19,在诱导培养16d后出现明显的成脂、成骨和成软骨细胞特性。hucMSCs共培养24、48和72 h,HaCaT细胞存活率较对照组分别显著增加了(20.42±3.90)%(P=0.002)、(36.30±8.08)%(P=0.001)和(27.31±10.04)%(P=0.012),与形态学观察结果一致。划痕后继续培养12h,对照组、共培养组HaCaT的空白区域面积分别为(36354.19±1705.32)μm^2、(29497.63±1286.49)μm^2(P=0.045),培养24 h,其空白区域面积分别减少为(13086.65±1695.85)μm^2、(2895.69±224.32)μm^2(P=0.014)。qRT-PCR结果显示,共培养处理24h后huc MSCs组KGF-2、TGF-β1基因表达分别上调为对照组的1.24倍和1.92倍;共培养48 h后KGF-2、TGF-β1和FGFR-2分别上调2.01倍、2.26倍和1.34倍,细胞外基质蛋白Fibronectin转录水平显著上调为对照组的1.59倍,MMP-1降低至对照组的0.52倍。结论hucMSCs能够显著促进HaCaT细胞的增殖与迁移,这可能与hucMSCs调节HaCaT增殖、迁移相关生长因子及细胞外基质蛋白的基因表达水平有关,提示hucMSCs是有潜力的表皮创伤愈合种子细胞。