FMDV 3D基因真核表达质粒的构建、表达及对Ⅰ型IFN信号通路的作用

本研究旨在构建口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)3D基因真核表达质粒,并探究其对Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)信号通路的作用。根据GenBank序列合成3D基因并将其插入真核表达载体pXJ41构建真核表达质粒pXJ41-Myc-3D,经PCR、双酶切及测序鉴定正确后分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞,Western blotting及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测3D蛋白在细胞内的表达及定位。通过双荧光素酶报告基因(Luciferase)、Real-time PCR、TCID50等试验检测HEK-293T细胞中过表达3D蛋白对水疱性口炎病毒(Versicular stomatitis virus,VSV)诱导的Ⅰ型IFN信号通路的影响。结果显示,真核表达质粒pXJ41-Myc-3D构建成功;3D蛋白在HEK-293T细胞中表达,大小约为55 kDa,主要定位在细胞核中;3D蛋白抑制了VSV诱导的IFN-β启动子活性和IFN-β mRNA水平,促进了VSV的复制。本研究为深入探究3D蛋白抑制Ⅰ型IFN信号通路的作用机制奠定了基础。

猪TRIM56全长及其截短体真核表达质粒的构建及蛋白的表达和定位

本研究构建了猪TRIM56(sTRIM56)全长及其截短体的真核表达质粒,并检测了其融合蛋白的表达和定位。首先,根据sTRIM56基因序列及结构特点,设计扩增全长及4个截短体的引物,提取猪肺泡巨噬细胞3D4/21的总RNA,RT-PCR扩增sTRIM56全长及截短体基因,并将其克隆至pXJ41真核表达载体,构建全长及其截短体的真核表达质粒。其次,将sTRIM56全长及截短体真核表达质粒转染HEK-293T细胞,Western blotting检测其蛋白表达;转染猪肺泡巨噬细胞3D4/21,间接免疫荧光试验(IFA)检测其亚细胞定位。双酶切和测序结果显示,sTRIM56全长及截短体的真核表达质粒构建成功;sTRIM56蛋白约为82 kDa,与预期相符,各截短体蛋白条带也与预期相符;sTRIM56全长及4个截短体蛋白均主要定位于细胞质中。本研究结果可为后续深入研究sTRIM56蛋白及其不同结构域的抗病毒作用及分子机制奠定基础。

猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建1株猪TRIM56基因敲除的PAM-KNU细胞系,并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)疫苗毒株中的应用。根据猪TRIM56基因组外显子区域设计合成2对特定的向导RNA引物,将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞,经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养;通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定,最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系,利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID_(50))以及Western blot检测PRRSV增殖情况。结果显示,TRIM56敲除细胞系构建成功,该敲除细胞系中sTRIM56基因编码区第929~2120位1192个碱基缺失,未检测到sTRIM56蛋白条带;敲除细胞系中PRRSV R98疫苗株病毒拷贝数、病毒滴度以及N蛋白表达均显著高于对照组。本研究为猪TRIM56抗病毒机制研究及PRRSV疫苗研发奠定了基础。

提高母猪年生产力的精细管理技术

母猪年生产力(PSY)是衡量母猪生产性能的综合指标,是种猪场高效可持续发展的关键所在。养猪生产相关设施与操作应以猪为本,精准管理,充分发挥猪只生产潜能,实现稳产、高产。对母猪精细管理进行探讨,从加强猪场基础设施建设、福利养猪、选育高产种猪、提高断乳仔猪成活率等方面详细介绍了提高母猪年生产力的精细管理技术。

粪菌移植结合噬菌体抵抗雏鸡沙门氏菌感染的作用

本试验研究了粪菌移植(fecal microbiota transplantation)与噬菌体(phage)的结合疗法抵抗雏鸡肠炎沙门氏菌感染的作用。试验设置4个处理,分别为Ca组(口服PBS缓冲液且攻毒)、Cb组(口服PBS缓冲液且不攻毒)、FPa组(粪菌移植与噬菌体结合疗法且攻毒)和FPb组(粪菌移植与噬菌体结合疗法且不攻毒)。每组隔离饲养至40日龄,记录不同日龄每组鸡的死亡率和体重变化,病理切片法分析肠道绒毛长度、隐窝深度和肝脏病理变化,PCR方法检测肝脏中沙门氏菌的定殖情况,ELISA方法检测血清中细胞因子水平。结果表明:粪菌移植与噬菌体的结合疗法可以降低沙门氏菌感染导致的雏鸡死亡率,促进雏鸡的体重增长;在一定程度上提高了雏鸡的免疫水平,减少了攻毒雏鸡肝脏的炎性病变,清除了肠炎沙门氏菌在雏鸡肝脏中的定殖;增强了雏鸡的消化吸收能力。综上,粪菌移植与噬菌体的结合疗法能帮助雏鸡抵抗沙门氏菌的感染,并促进雏鸡的健康生长。

禽类三种常见病原菌快速检测体系的建立及应用

鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌是禽类3种常见的革兰氏阴性致病菌。为实现3种病原菌的快速检测,选择各自的保守基因ompA、phoA和fimW,建立并优化了同时鉴定3种病原菌的多重PCR方法。3个引物对的最佳终浓度分别为0.60、0.28、0.20μmol/L,最佳退火温度为57℃;该方法能从其他7种临床常见病原菌中特异性区分出鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌;在DNA水平和菌水平的最低检测限分别达到1 pg/μL和10^(4)cfu/mL。本试验建立的多重PCR方法特异性和敏感性好,检测成本低、效率高,适用于禽类常见3种临床重要病原菌单一或混合感染的快速诊断及流行病学调查。

肠炎沙门氏菌攻毒对SPF雏鸡粪便微生物区系的影响

试验旨在探究肠炎沙门氏菌攻毒对SPF雏鸡粪便微生物区系的影响。选择1日龄SPF雏鸡24只,随机分为2组,每组12只。在4日龄处理组口服107 CFU肠炎沙门氏菌(ATCC13076)攻毒,对照组口服等量PBS溶液。试验期22 d。结果显示:①处理组SPF鸡的存活率为75%,对照组全部存活,期间两组鸡的体重无显著性差异;②OTU水平上,相同日龄两组鸡粪便菌群的丰富度相近,中期处理组粪便菌群多样性更高(P<0.05),后期对照组菌群稳定性更高,而且攻毒对SPF鸡粪便菌群的影响随日龄增加而减弱;③在属水平上,与对照组相比,处理组Bacteroides(拟杆菌门)、Enterococcus(肠球菌属)和Aeriscardovia(卡多维亚氏菌属)的相对丰度明显升高(P<0.05);Lactobacillus(乳杆菌属)、Alistipes(另枝菌属)、Faecalibacterium(粪杆菌属)、Romboutsia(罗姆布茨菌属)和Ruminococcaceae_UCG_005(瘤胃球菌UCG_005)的相对丰度明显降低(P<0.05);④KEGG分析显示攻毒影响了菌群参与的多个代谢通路。综上,肠炎沙门氏菌感染影响了SPF雏鸡粪便菌群的结构组成、稳定性及菌群参与的代谢通路。Bacteroides(拟杆菌门)、Lactobacillus(乳杆菌属)等差异菌属可能对SPF雏鸡抵抗沙门氏菌入侵起到积极作用。

猪RNase L与PRRSV nsp4缺失突变体的构建及其互作研究

RNase L是一种独特的核糖核酸内切酶,在机体的抗病毒过程中发挥重要作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白4(nsp4)具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,是参与病毒多聚蛋白前体切割的主要蛋白酶,是影响病毒粒子成熟的重要蛋白。课题组前期研究发现猪RNase L(sRNase L)能够与nsp4互作发挥抗PRRSV作用。为了筛选sRNase L与nsp4互作的区段或位点,本研究分别构建了sRNase L与nsp4的截短体或突变体,通过免疫共沉淀试验进行筛选,结果显示突变体sRNase L R460A、sRNase L R675A、sRNase L Y720A、sRNase L F724A都能够与nsp4发生互作,只有缺失体sRNase L 1~586 aa不与nsp4互作,表明sRNase L第3结构域(587~744 aa)为与nsp4互作区段,但该区段不包括第675位精氨酸、第720位酪氨酸、第724位苯丙氨酸;分别包含nsp4三个结构域的截短体nsp4-D1(1~80 aa)、nsp4-D2(60~156 aa)、nsp4-D3(157~204 aa)中,只有nsp4-D1与sRNase L发生互作,表明nsp4的1~60 aa为与sRNase L互作区段。本研究为进一步探究sRNase L与nsp4互作抗PRRSV机制奠定了基础,为预防和控制PRRSV感染提供了新的思路和方法。

柴油机可变相位参数耦合对气路状态的影响

为研究单位附加升程持续角和单位附加升程峰值与原机气门型线峰值间隔角的耦合作用对气路状态参数的影响,以DK4A柴油机为研究对象,在发动机转速为2800 km·h^-1,50%负荷工况下,导入不同气门升程型线进行模拟.分析了单位附加升程持续角和单位附加升程峰值与原机气门型线峰值间隔角对气路状态参数影响权重的变化规律.结果表明:单位附加升程峰值与原机气门型线峰值间隔角为100°~140°,单位附加升程持续角为92°~132°,两者耦合作用对进气状态参数变化率的影响存在权重相等的情况;单位附加升程峰值与原机气门型线峰值间隔角的增加有利于增加其对气路状态参数的影响权重,且单位附加升程峰值与原机气门型线峰值间隔角对进气状态参数变化率的影响权重大于单位附加升程持续角的影响权重.

超声波清洗在贵/廉金属复合材料生产过程的应用研究

本文结合“ODS清洗剂消费淘汰项目”的实施,并对新型超声波清洗机及新型ODS清洗液进行了工艺试验,阐述了超声波清洗技术是贵/廉金属复合材料生产过程中无可替代的清洗技术。

贵金属纳米粉体材料的制备方法及其应用

简述贵金属纳米粉体材料的制备方法,介绍贵金属纳米粉体材料的应用前景。

正丁醇/柴油掺烧与气路氧耦合作用对碳烟生成的影响研究

基于一台压气机和经过改装的轻型柴油机实现了模拟增压状态下正丁醇与柴油的掺烧。试验研究了在转速1500 r/min、BMEP0.5 MPa、进气压力120 kPa的工况下,进气氧浓度分别为20.9%~16%(富氧阶段)、16%~12.5%(高温贫氧阶段)和12.5%~11%(低温贫氧阶段)情况下,柴油/正丁醇掺烧燃料随进气氧浓度降低对碳烟排放的影响规律。研究结果表明:随进气氧浓度从20.9%降低至11%,影响碳烟排放的主要因素从温度变为燃料氧,最后变为温度和燃料氧;在富氧阶段,由于氧气氛围较为充足,碳烟氧化对燃料氧的依赖作用较弱,影响碳烟生成的主要因素为温度;在高温贫氧阶段,氧气浓度较低,燃料氧是影响碳烟排放的主要因素,温度对碳烟的影响作用其次;在低温贫氧阶段,温度和燃料氧是影响碳烟排放的主要因素,滞燃期对碳烟排放几乎无影响作用。