α1-Giardin的原核表达与多克隆抗体制备

目的原核表达α1-Giardin并制备兔抗rα1-Giardin多克隆抗体。方法以蓝氏贾第鞭毛虫DNA为模板,PCR扩增α1-giardin编码基因片段,经双酶切后连入原核表达载体pET-41a(+),构建重组表达载体pET-41a(+)-α1-giardin,热激法转化大肠埃希菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后收集菌体并裂解,采用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达,采用His-tag亲和层析柱纯化融合蛋白。将α1-Giardin蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化后免疫新西兰白兔,隔周以同样剂量蛋白加等体积弗氏不完全佐剂加强免疫2次。末次免疫后一周颈动脉取血,制备多抗血清,采用间接ELISA法测定抗体效价。结果成功构建原核表达载体pET-41a(+)-α1-giardin,转化大肠埃希菌后经IPTG诱导表达分子质量单位为34.8ku的可溶性蛋白;经His-tag亲和层析柱纯化获得高纯度的重组α1-giardin蛋白,制备的免疫兔抗血清ELISA滴度为1∶51 200。结论成功克隆、表达并纯化了贾第虫α1-giardin蛋白,制备了高滴度的抗α1-giardin多克隆兔血清,为以α1-Giardin为抗原的疫苗研究奠定了基础。

棘阿米巴原虫actin1基因原核表达载体构建与鉴定

棘阿米巴角膜炎的临床诊断比较困难,以角膜刮片的病原学诊断为主,样本采集困难,临床诊断率低。本研究构建了棘阿米巴原虫actin1基因进行原核表达载体,并进行鉴定。以棘阿米巴滋养体cDNA为模板,通过特异性引物,经聚合酶链反应,获得actin1基因开放阅读框（ORF）片段,进行克隆及序列分析,经双酶切,连接,构建重组表达载体pET22b（＋）-actin1。将重组载体转化入大肠杆菌（E.coli）DH5α,筛选出阳性菌落,经PCR扩增和酶切鉴定后,阳性质粒送样测序;提取阳性质粒,转化入E.coli BL21（DE＋）,1mol/L IPTG诱导重组蛋白r-actin1的表达。自棘阿米巴滋养体cDNA扩增得到约774bp的actin1基因片段;经PCR和酶切鉴定表明,重组表达载体pET22b（＋）-actin1构建成功;重组菌株BL21（DE＋）/pET22b（＋）-actin1,经培养、诱导、SDS-PAGE电泳,出现1条相对分子质量约为30 000重组蛋白条带,r-actin1表达诱导表达成功。成功构建重组表达载体pET22b（＋）-actin1,并诱导表达。