河北省廊坊市牛主要病毒性腹泻病原感染状况检测及牛冠状病毒演化分析

牛病毒性腹泻病原严重危害畜牧业生产,BVDV、BoAstV、BCoV、MRV、BKoV、BoNeV、BNoV、BRV、BToV被认为是引起牛群腹泻的病原,不仅如此,BVDV、BCoV和BToV除了能引起消化道症状外还能引起呼吸道症状,BVDV不仅能引起消化道和呼吸道症状,还会导致母牛生殖功能异常,这些疾病对畜牧业造成巨大的经济损失。为了解牛主要病毒性腹泻病原流行情况,本次试验通过PCR检测方法对我国河北地区323份腹泻牛粪样品进行常见9种病毒性牛腹泻病原进行检测。结果显示,BVDV阳性检出率1.85%(6/323)、BCoV阳性检出率14.24%(46/323)、BRV阳性检出率57.89%(187/323)、BoAstV阳性检出率0.31%(1/323)、BoNeV阳性检出率10.84%(35/323)、BNoV阳性检出率4.33%(14/323)、MRV阳性检出率2.48%(8/323)、BToV阳性检出率4.64%(15/323)、BKoV阳性检出率11.76%(38/323)。混合感染共有76份,占比23.53%(76/323)。HBLF2302株的全基因序列、S、HE、N、M和E基因进行同源性和遗传进化分析发现,HBLF2302与BCoV/NMG1/2022基因同源性最高,为GIIb亚型。基于氨基酸序列比对和HBLF2302的S蛋白三级结构预测发现,在S蛋白中157号位突变为157T,854号位点突变为854I。318V为独特突变,改变了与侧链残基的作用力,与631C形成氢键连接。并发现中国株区别于其它地区的GⅡb亚型,位于ORF1a区域有三个独特位点。本研究丰富了牛腹泻病原的流行病学数据,为牛腹泻病的防控奠定基础。

牛冠状病毒S1蛋白的真核表达及间接ELISA方法的建立与应用

为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫High5细胞培养基上清,经Western blot鉴定S1蛋白抗原性良好;经反应条件优化,确定抗原包被浓度为0.125μg·mL^(-1),血清稀释度为1∶200;采用1%明胶,于37℃封闭3 h;血清样品于37℃孵育30 min;酶标二抗的稀释度1∶25000,37℃孵育45 min;37℃避光显色13 min;临界值为0.297;经检验,该方法特异性良好;批间及批内变异系数均小于10%。当临界值为OD_(450 nm)为0.297时,若以IFA为标准,ELISA的敏感性为96.88%(31/32),特异性为87.50%(7/8),与IFA具有很强的一致性(κ=0.844,P<0.01);若以中和试验为标准,ELISA的敏感性为100.00%(31/31),特异性为88.89%(8/9),与血清中和试验具有很强的一致性(κ=0.925,P<0.01)。采用该方法对303份牛血清进行检测,BCoV阳性率为74.91%。由此说明,本研究建立的ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于BCoV的血清学调查和临床诊断,并可以应用于替代中和试验检测BCoV免疫后抗体水平。

枯草芽孢杆菌4种环脂肽抗猪δ冠状病毒的研究

为探究从枯草芽孢杆菌Bs 916中提取的表面活性素、罗克霉素、泛革素及杆菌霉素L 4种抗菌肽对猪δ冠状病毒(PDCoV)的抗病毒作用。首先采用CCK-8法确定抗菌肽对细胞无毒性的最佳浓度范围,随后分别采用RT-qPCR、Western blot及IFA 3种方法检测Bs 916中4种环脂肽对PDCoV的抗病毒效果。结果显示,4种环脂肽在浓度≤50μg/mL时对细胞无毒性,同时具有良好的抗病毒效果。相同条件下,罗克霉素抗病毒效果最佳,其次为表面活性素。本研究从枯草芽孢杆菌Bs 916中提取的表面活性素、罗克霉素、泛革素及杆菌霉素L可抑制PDCoV在细胞中的增殖,具有良好的抗病毒作用,其中以罗克霉素和表面活性素的抗病毒效果最佳,可为抗PDCoV药物研发提供理论支持。

羊腹泻样本中大肠杆菌的分离、毒力基因与耐药性分析

为确定华东地区发生腹泻的羊群中大肠杆菌感染、毒力基因携带及耐药性情况,本研究通过分离鉴定、进化分群、毒力基因检测、药敏试验等方法对发生腹泻的羊场病死羊肠道、粪便样品进行检测。结果显示,从187份样品中分离到163株大肠杆菌,其中B1群及A群的菌株占大多数,检出率分别为59.51%和28.83%;B2和D群的检出率分别为9.82%和1.84%。对分离菌株31个毒力基因进行检测,结果表明yijp、crlA、mat、ompA、fimC、ibeB 6种毒力基因的检出率均大于87%;所有菌株均未检出毒力基因afa/draB和LT。fimC、mat、crlA、ibeB、yijp及ompA在各进化群大肠杆菌均广泛存在。根据毒力基因检测结果,有72株菌为产志贺毒素大肠杆菌(STEC),主要携带毒力基因stx2。STEC另一标志性毒力基因eae检出率为61.11%。药敏试验检测的16种抗菌药中有4种的耐药率大于80%,有13种大于50%。属于多重耐药(MDR)的菌株有150株,占92.02%,且多为五重及以上耐药菌(84.05%)。华东地区临床流行的羊源大肠杆菌菌株毒力基因多样、耐药性普遍且耐药性强。该结果为本地区羊大肠杆菌病的防控提供了科学依据。

稳定表达3种猪腹泻病毒嵌合抗原的CHO细胞系构建与鉴定

为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)主要抗原的CHO细胞系,为猪病毒性腹泻三联疫苗的研发提供基础材料,本研究将PEDV的S基因的COE区域、TGEV和PDCoV的S基因的受体结合区域(RBD),通过同源重组的方式进行融合,克隆到慢病毒表达质粒pLV-EF1a-IRES-Puro中,包装得到重组慢病毒。使用重组慢病毒感染CHO细胞,经过嘌呤霉素和单克隆细胞筛选,基因水平和蛋白水平表达验证,成功构建了稳定表达3种猪腹泻病毒抗原融合蛋白的CHO细胞系,为进一步研制PEDV-TGEV-PDCoV的亚单位疫苗奠定了基础。

1株猪流行性腹泻病毒CH/JSNT/2022/Jan株的分离及其S基因遗传进化分析

2022年1月份江苏南通一养猪场产房仔猪发生严重腹泻,发病率和死亡率均超过80%,原因未知。死亡仔猪肠道样本经RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PoRV),结果显示:仅PEDV检测为阳性,TGEV、PDCoV和PoRV检测均为阴性。将处理好的肠内容物接种Vero细胞,接种后48 h即观察到典型细胞融合、聚集成合胞体的PEDV典型细胞病变,且能够在Vero细胞上稳定传代,表明成功分离到病毒,并将其命名为CH/JSNT/2022/Jan株。通过电镜观察,观察到近似球形、直径约为100 nm、表面有囊膜和纤突的冠状病毒样粒子,表明分离毒株可能为PEDV。进一步对该毒株的S基因进行测序,序列相似性分析结果显示,分离毒株CH/JSNT/2022/Jan与PEDV S基因参考毒株的核苷酸序列相似性为93.5%~99.7%,氨基酸序列相似性为92.8%~99.9%;遗传进化分析结果显示,该分离株为GⅡa型,与多个2020年和2021年中国流行株处于同一进化分支,与疫苗株CV777、AJ1102和LW/L的遗传进化距离较远。研究结果表明,PEDV的田间流行株在不断变化,流行株的分离对PEDV疫苗研发和新的防控策略的制定具有重要意义。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立及国内部分地区流行病学调查

牛冠状病毒(BCoV)在全球广泛存在,在临床上能引起牛腹泻以及呼吸道感染,给养殖业带来巨大经济损失。为快速批量检测临床样品、分析国内的BCoV隐性感染及流行情况,根据BCoV的N基因序列设计了引物和探针,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,对其特异性、敏感性、重复性进行评估,并将其与靶向BCoV的N基因的常规RT-PCR方法进行对比。利用本方法对采集自我国西藏、江苏、河北、贵州、安徽等5个省份的22个未发病牛场的35份口腔拭子样品和244份粪便样品进行检测以了解流行情况。结果表明,质粒标准品拷贝数的对数与C T值呈现良好稳定的负线性关系,标准曲线为y=-3.4418 x+39.5840,r^(2)=0.9994,E=98.2%;最低检测拷贝数为6.0×10拷贝/μL,重复性变异系数均<5%;对临床样品进行检测,检出率明显高于常规RT-PCR方法。对22个牛场的279份病料进行检测,结果显示BCoV的总体阳性率为73.12%,牛场阳性率为100.00%。本研究成功建立了靶向BCoV N基因、灵敏度高、特异性好的荧光定量RT-PCR检测方法,并初步掌握了我国5个省份BCoV的流行现状,为后续BCoV研究奠定了基础。

猪δ冠状病毒结构蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

旨在获得猪δ冠状病毒(PDCoV)结构蛋白并评价其免疫原性。通过RT-PCR技术,扩增PDCoV CZ2020株中完整的S、E、M和N基因,克隆至pCAGGS真核表达载体,构建pCAGGS-PDCoV-S、pCAGGS-PDCoV-E、pCAGGS-PDCoV-M、pCAGGS-PDCoV-N真核表达质粒,经测序鉴定后转染HEK293T细胞,采用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot(WB)方法检测PDCoV的S、E、M、N蛋白表达。将4种蛋白分别皮下注射BALB/c小鼠,制备重组蛋白多克隆抗体,并用WB法和IFA法测定抗体效价,评价免疫原性。结果表明,重组质粒pCAGGS-PDCoV-S、pCAGGS-PDCoV-E、pCAGGS-PDCoV-M、pCAGGS-PDCoV-N能够在HEK293T细胞内正常表达,并与PDCoV阳性猪血清特异性结合。制备的4种重组蛋白的多克隆抗体效价可达1∶10 000以上,表明重组蛋白可诱导小鼠产生高水平抗体。本研究制备的多克隆抗体具有较强的免疫原性,能够为研制诊断试剂盒和新型疫苗提供基础。

猪δ冠状病毒结构蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

为了获得猪δ冠状病毒(PDCoV)结构蛋白并评价其免疫原性,通过RT-PCR技术,扩增PDCoV CZ2020株中完整的S、E、M和N基因,克隆至pCAGGS真核表达载体,构建pCAGGS-PDCoV-S、pCAGGS-PDCoV-E、pCAGGS-PDCoV-M、pCAGGS-PDCoV-N真核表达质粒,经测序鉴定后转染HEK293T细胞,采用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot(WB)方法检测PDCoV的S、E、M、N蛋白表达。将4种蛋白分别皮下注射BALB/c小鼠,制备重组蛋白多克隆抗体,并用WB法和IFA法测定抗体效价,评价免疫反应性。结果:重组质粒pCAGGS-PDCoV-S、pCAGGS-PDCoV-E、pCAGGS-PDCoV-M、pCAGGS-PDCoV-N能够在HEK293T细胞内正常表达,并与PDCoV阳性猪血清特异性结合;制备的pCAGGS-PDCoV-S、pCAGGS-PDCoV-E、pCAGGS-PDCoV-M和pCAGGS-PDCoV-N的多克隆抗体效价可达1∶10 000以上,表明重组蛋白可诱导小鼠产生高水平抗体。结果表明pCAGGS-PDCoV-S、pCAGGS-PDCoV-E、pCAGGS-PDCoV-M和pCAGGS-PDCoV-N真核表达质粒成功构建,试验制备的多克隆抗体具有较强的免疫反应性,能够为研制诊断试剂盒和新型疫苗提供基础。

规模化养猪场环境细菌的调查与分析

为掌握规模化养猪场周围环境中的细菌数量与种类,以便为养猪场细菌性疾病的预防与控制提供依据,本试验在贵州省2个具有代表性的规模化养猪场中采集空气、饮用水、排污水、土壤和粪便样本进行细菌总数检测和优势菌落鉴定,结果显示,2个猪场的空气、饮用水、排污水、粪便和土壤样本细菌总数相应为(1.17～94.40)×104CFU/m3、(0.15～1.83)×102CFU/mL、(5.00～32.00)×105CFU/mL、(0.46～26.40)×106CFU/g和(0.30～52.30)×105CFU/g,主要优势菌是葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、耶尔森菌、变形杆菌、巴氏杆菌、李氏杆菌、芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌等。这些结果显示,除饮用水和土壤外,其余样本的细菌总数都符合国家规定的畜禽养殖场环境卫生要求,但存在一些条件致病菌或致病菌,这为养猪场细菌性疾病的预防与控制提供了重要的参考数据。

贵州省规模养猪场主要病原菌的耐药性检测

为掌握贵州省规模养猪场病原菌的耐药情况,对3个地州市6个规模养猪场的空气、污水、粪便和土壤样本中分离鉴定的4种主要病原菌(大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和链球菌共97株)采用药敏纸片琼脂扩散法进行细菌耐药性分析。结果表明,4种主要病原菌均存在广泛的耐药性,即呈现多重耐药现象,其中大肠杆菌和沙门氏菌尤为突出;在选用的20种抗生素中,以青霉素、四环素、洁霉素、红霉素、痢特灵和罗红霉素的抑菌效果最差。

1株绵羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及致病性研究

为确定导致绵羊细菌性感染死亡的病原,从送检病死绵羊肺脏中分离纯化出1株细菌,并对其进行培养特性观察、生化反应、PCR鉴定、药敏试验和动物致病性试验。结果显示,分离纯化的细菌为革兰氏阴性短杆菌,经生化反应和PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌;该细菌对庆大霉素、头孢噻肟高度敏感;对青霉素、四环素、红霉素、利福平、卡那霉素、恩诺沙星和大观霉素耐药;将1×10~9CFU/m L菌液10倍系列稀释后感染6~8周龄小白鼠,该细菌对小白鼠的半数致死量为1×10^(6.2)CFU/m L;死亡动物的剖检病变与发病绵羊类似,并从病变器官内分离到细菌。本研究为进一步探讨溶血性曼氏杆菌的致病机理奠定了基础。

伪结核棒状杆菌的分离鉴定及病原性研究

从疑似羊干酪性淋巴结炎的肩前淋巴结脓肿中分离到1株细菌,经革兰氏染色为无芽孢的阳性棒状杆菌;伪结核棒状杆菌特异性引物进行PCR扩增测序表明,该细菌的序列与伪结核棒状杆菌同源性达99.0%以上,确定其为伪结核棒状杆菌。用15种常用抗生素纸片进行药敏试验,结果显示,该菌对青霉素、头孢曲松、左氧氟沙星和氟苯尼考高度敏感;对链霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星、林可霉素和大观霉素耐药。致病性试验发现,腹腔注射小白鼠的半数致死量为1×10-6.0CFU/m L;皮下注射小白鼠2 d后出现大小不等的脓肿;分别用2×108、2×106CFU/m L 2种剂量皮下注射羊后出现体温持续升高,接种部位和周边的浅表淋巴结出现脓肿,切开后有干酪样脓汁,并从病变器官和脓汁中分离到细菌。组织病理学观察显示,皮肤和肌肉层有坏死灶及肉芽肿形成,肌纤维断裂坏死,淋巴细胞浸润,淋巴结出现化脓灶,并有大量上皮样细胞和成纤维细胞增生。本研究为伪结核棒状杆菌疫苗研制及致病机理研究奠定了基础。

一例犬子宫蓄脓的实验室诊断与治疗

犬子宫蓄脓是异常的子宫内膜继发病原微生物感染引起的子宫腔内积有脓液的疾病。外阴部不洁、配种、产后感染或死胎、难产助产感染等均可引起该病。笔者通过对贵州大学动物医院收治的一例病犬进行临床检查和实验室检查,确诊为子宫蓄脓后采取手术疗法治疗并取得成功;对子宫内容物进行病原菌分离鉴定、药敏试验,病原学分析显示,此犬子宫内病原菌为大肠杆菌,且该菌株对先锋霉素、头孢噻吩、卡那霉素和庆大霉素等药物敏感。本试验为犬子宫蓄脓诊治,预防及前期的药物选择提供临床指导。

山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞的miRNA表达谱变化分析

本研究旨在分析山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞和正常MDBK细胞差异表达的miRNA,以探索miRNA在CPIV3感染过程中的作用及其调控机制。将CPIV3感染MDBK细胞,利用高通量测序技术检测分析MDBK细胞中miRNA表达谱,并筛选差异表达的miRNA。对靶基因进行GO注释和KEGG富集。结果显示,有37个miRNA显著差异表达(P<0.001),其中18个miRNA在病毒感染中上调,19个miRNA在病毒感染中下调。经RT-qPCR方法验证5个差异表达的候选miRNA,结果与高通量测序分析有很好的一致性。进一步GO功能注释表明:差异表达的miRNA靶基因生物学功能相对集中在免疫调节、细胞生物调控及细胞新陈代谢等生物过程。这些靶基因参与多种细胞的信号通路,包括细胞黏附分子、B细胞受体信号通路、MAPK信号通路、代谢通路、黏合斑、钙离子信号通路和趋化因子信号通路等。本研究为进一步探讨CPIV3致病机制奠定了基础。

猪场环境大肠杆菌对小白鼠的致病性研究

为了解大肠杆菌的致病机理及为防治提供科学指导,用从规模养猪场的空气、污水、粪便和土壤样本中分离鉴定的大肠杆菌腹腔注射小白鼠,通过临床症状观察和病理学检查研究其致病性。结果表明,小白鼠出现精神萎靡、拉稀、眼帘粘连、消瘦、被毛蓬乱等临床症状,小白鼠致死率达51.3%,其中污水源和空气源样本菌株对小白鼠的致死率最高,均为66.7%。解剖病死小白鼠发现,肝脏灰色肿大,脾脏肿大、边缘呈暗紫色,十二指肠水肿等明显病变。病理组织学观察可见,肺脏毛细血管充血、出现肺气肿及肺泡间隔增宽,心肌纤维断裂、排列紊乱,肝细胞肿大、变性及肝窦出血,十二指肠上皮细胞变性坏死、肠绒毛脱落等病变。说明,猪场环境大肠杆菌致病性较强,以小白鼠建立动物模型研究其致病机制对大肠杆菌病的诊断及防治具有重大意义。

猪场环境大肠埃希菌耐药质粒消除研究

为了解耐药质粒消除对大肠埃希菌耐药性及其他生理特性的影响,参考前期试验分离出的8株携带aac(6’)-Ib质粒耐药基因的大肠埃希菌的药敏试验。选取1株耐药性最强菌株用高温及SDS进行耐药质粒消除,PCR检测aac(6’)-Ib基因。结果显示,耐药质粒成功消除,耐药性消失,且细菌在不含抗生素条件下培养,耐药性消除状态可稳定遗传;但在含卡那霉素条件下连续传代,其耐药性可迅速恢复,第4代即可产生耐药性。体外生长曲线显示,耐药质粒消除株生长较快,且较早进入对数期。以上数据表明大肠埃希菌多重耐药性主要由质粒决定,研究开发新型耐药质粒消除剂对克服大肠埃希菌耐药性具有重要意义。

猪场环境中主要病原菌耐药性分析

对贵州省6个规模养猪场圈舍内外空气、污水、粪便和土壤样本进行细菌总数测定,并对不同环境样本中分离的大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和链球菌进行药敏试验,以了解规模猪场环境细菌污染状况及主要病原菌的耐药性。结果显示,猪场环境细菌污染严重,其总数均一定程度地超出国家规定的卫生标准。其中,粪便样本含菌量最高,其次为污水、土壤样本,且粪便、污水和土壤样本细菌含量显著高于空气样本(0.01<P≤0.05);圈舍内空气中细菌浓度远远高于舍外细菌含量(0.01<P≤0.05)。药敏试验结果表明,猪场环境分离鉴定的细菌其耐药率较高。青霉素、四环素、洁霉素等传统抗生素已无明显抑菌效果,粪便、污水和土壤样本细菌耐药率均高于空气样本。

不同养殖模式下小反刍兽疫母源抗体消长规律

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、高度接触性传染病,是世界动物卫生组织法定须报告的具有重要经济影响的跨境传染病,山羊和绵羊易感,具有较高的感染率和死亡率。疫苗接种是预防控制小反刍兽疫的重要手段。当前,规模化羊场对小反刍兽疫的防控均实施了以疫苗接种为主的综合防制措施,但抗体检测发现时常存在羔羊免疫失败现象,这可能是羔羊首免日龄不当受到母源抗体干扰而导致的。为了解不同养殖模式与养殖条件下羔羊母源抗体的消长规律,为制定科学合理的小反刍兽疫免疫程序提供依据,在江苏省选择8个不同的山羊和湖羊养殖场,分别选取1月龄羔羊6只,定期采血,采用商品化竞争ELISA试剂盒检测羔羊母源抗体变化情况。结果表明,不同养殖场PPRV母源抗体的变化规律不一致,存在较大差异,大部分持续时间为1~3个月,个别湖羊场羔羊4月龄时母源抗体仍呈现极高水平。生产实际中须要做好母羊和羔羊小反刍兽疫抗体水平的监测,根据监测结果制定科学的免疫程序。

链球菌通用PCR检测方法的建立及应用

为建立链球菌快速检测方法，根据链球菌延伸因子ERTu基因设计合成1对通用引物，对链球菌属及其他属细菌进行PCR检测。结果表明，所设计的通用引物对猪链球菌2型和无乳链球菌均能扩增出1条大小为197bp的特异性DNA条带，而对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、都柏林沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌均呈阴性反应；经对PCR产物进行测序分析表明，扩增片段与GenBank上链球菌相应序列的同源性达90％～98％；对链球菌DNA样本不同稀释度的检测显示，该PCR的最低检出量可达0．1ng／mL；利用PCR检测方法对11株链球菌分离物进行检测，结果均能扩增出与预期大小相一致的目的条带，与传统生化鉴定结果符合率达到100％。这些结果表明，已成功建立了链球菌PCR检测方法，并可应用于临床链球菌的鉴定。