解淀粉芽孢杆菌B10抑制黄曲霉生长活性物质克隆表达及作用效果研究

本试验旨在从解淀粉芽孢杆菌B10中克隆表达出能够抑制黄曲霉生长的活性物质,验证其黄曲霉抑制活性,明确其抗菌作用方式。试验通过克隆表达及亲和层析纯化操作成功得到重组1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(B10-Glu)及抗菌肽LCI(B10-LCI),并对二者基本生物学信息进行分析。平板抑菌试验验证抑菌活性后,探究B10-Glu、B10-LCI最小抑菌浓度(MIC)及环境条件对二者抑菌效果的影响。通过电镜观察、细胞膜通透性及线粒体膜电位变化、活性氧(ROS)含量及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测,探究B10-Glu、B10-LCI黄曲霉抑制方式。结果表明:1)B10-Glu及B10-LCI的表观分子质量分别为25及12 ku,与预测分子质量较为接近。B10-LCI最佳诱导条件为16℃诱导16 h,B10-Glu为25℃诱导12 h。2)B10-Glu及B10-LCI对黄曲霉均有清晰明显的抑制效果,抑菌圈半径分别为1.14及1.17 cm。MIC分别为0.94及0.96μg/mL。3)B10-Glu及B10-LCI均能抑制黄曲霉孢子形成;破坏其菌丝形态及细胞内部结构;提高黄曲霉细胞膜通透性,致使细胞内容物流失;破坏线粒体等细胞器,促使ROS积累并降低细胞抗氧化水平。综上所述,B10-Glu及B10-LCI能通过抑制黄曲霉生长繁殖过程、破坏其细胞结构来发挥二者的优良抗黄曲霉作用效果。

1株黄曲霉颉颃菌的鉴定及其抑菌活性成分分析

【目的】筛选黄曲霉颉颃菌,探究其最佳培养条件及有效抗菌成分,为实际生产中应用生物防治方法抑制黄曲霉污染提供新的理论依据。【方法】通过平板对峙法及分子生物学鉴定方法对待测菌株进行筛选鉴定。以抑菌率作为衡量标准,判断所得黄曲霉颉颃菌的最佳培养温度、培养时间、接种量、转速、pH及装液量。通过硫酸铵沉淀法从颉颃菌无菌发酵上清液中提取蛋白,观测粗提物对黄曲霉菌丝生长的影响。通过离子交换色谱和凝胶过滤色谱进一步纯化粗提蛋白,并进行质谱测序及序列对比分析,筛选鉴定颉颃菌产生的有效抑菌成分。【结果】筛选到1株解淀粉芽孢杆菌B10(菌种保藏号CCTCCNO:M2018353)。最佳培养条件为温度40℃,培养时间36 h,接种量3%,转速120 r/min,pH 6.0,装液量30 mL,最大抑菌率可达46.56%。其粗提蛋白能有效抑制黄曲霉生长,破坏菌丝正常形态,并从中筛选出几丁质结合蛋白、壳聚糖酶、葡聚糖酶等8种可能的有效抑菌成分。【结论】本试验分离鉴定出1株抑制黄曲霉正常生长发育的解淀粉芽孢杆菌B10,其产生的多种蛋白成分对黄曲霉有显著抑菌活性。